成年大鼠雙眼形覺剝奪后視皮層可塑性再激活機(jī)制研究.pdf

1、弱視是指在視覺發(fā)育敏感期，由于缺乏清晰視網(wǎng)膜圖象刺激導(dǎo)致矯正視力低于正常的疾病，幼兒弱視有一定治療效果，但成年弱視目前尚無(wú)有效治療方法。哺乳動(dòng)物包括人類出生后，視覺系統(tǒng)能夠根據(jù)視覺環(huán)境及時(shí)調(diào)整和改變自身的神經(jīng)聯(lián)系和突觸結(jié)構(gòu)，這一改變發(fā)生的最敏感時(shí)期稱為視覺發(fā)育可塑性關(guān)鍵期。單眼剝奪(monoculardeprivation，MD)是研究哺乳動(dòng)物視皮層可塑性的經(jīng)典模型。以往研究認(rèn)為，只有在關(guān)鍵期內(nèi)的短期(3天)MD才能造成眼優(yōu)勢(shì)移動(dòng)，即只

2、有在關(guān)鍵期內(nèi)的視皮層才具有可塑性。 目前對(duì)幼年動(dòng)物視皮層可塑性關(guān)鍵期啟動(dòng)和終止機(jī)制的研究證實(shí)，視皮層突觸可塑性依賴于皮層抑制和興奮神經(jīng)通路的平衡。研究發(fā)現(xiàn)，自出生后雙眼即被縫合或黑暗飼養(yǎng)的動(dòng)物，其視皮層內(nèi)GABA和NMDA受體的成熟受到嚴(yán)重影響，視覺發(fā)育維持在不成熟狀態(tài)，抑制和興奮神經(jīng)通路平衡受到影響，從而延長(zhǎng)了可塑性關(guān)鍵期。西南醫(yī)院眼科實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用腦片膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)對(duì)大鼠視皮層進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在正常大鼠可塑性關(guān)鍵期內(nèi)，隨著發(fā)

3、育，NMDA受體相對(duì)于AMPA受體的作用逐漸減弱，雙眼形覺剝奪(binocularformdeprivation，BFD)通過(guò)NMDA受體與AMPA受體的相互作用影響了視皮層神經(jīng)元興奮性突觸傳遞的功能可塑性。同時(shí)，西南醫(yī)院眼科實(shí)驗(yàn)室對(duì)正常及BFD大鼠視皮層Ⅳ層GABA能神經(jīng)元抑制性突觸后電流(inhibitorypostsynapticcurrents，IPSCs)進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)正常大鼠GABA能抑制性回路神經(jīng)元突觸發(fā)育的高峰期遲于谷氨

4、酸能興奮性回路神經(jīng)元，IPSCs峰值在成年后則保持在穩(wěn)定的高水平；在可塑性關(guān)鍵期內(nèi)，BFD抑制了大鼠GABA能抑制性突觸傳遞功能發(fā)育。 2002年P(guān)izzorusso等的研究結(jié)果為關(guān)鍵期終止后成年視皮層可塑性再激活提供了直接證據(jù)，他們采用chABC酶注入大鼠顱腔，降解視皮層硫酸軟骨素，成功恢復(fù)了成年大鼠視皮層眼優(yōu)勢(shì)移動(dòng)。然而，該方法有破壞性，臨床應(yīng)用存在明顯局限性。那么能否通過(guò)自然的、無(wú)創(chuàng)的異常視覺環(huán)境再激活成年視皮層可塑性呢?

5、近期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間黑暗飼養(yǎng)的成年大鼠在短期MD后也能導(dǎo)致眼優(yōu)勢(shì)移動(dòng)。這種無(wú)創(chuàng)方法成功再激活成年動(dòng)物視皮層可塑性，提示異常視覺環(huán)境同樣可影響成年視皮層，只是這些異常視覺環(huán)境需要對(duì)成年動(dòng)物作用更長(zhǎng)時(shí)間。與黑暗飼養(yǎng)模型比較，雙眼瞼縫合后所致的形覺剝奪是一種更接近臨床的動(dòng)物模型。 既然黑暗飼養(yǎng)和BFD后的幼年動(dòng)物能夠通過(guò)影響抑制和興奮性神經(jīng)通路的成熟，使其視覺發(fā)育維持在不成熟狀態(tài)，從而延長(zhǎng)可塑性關(guān)鍵期，而成年大鼠的視皮層可塑性在黑暗飼

6、養(yǎng)一定時(shí)間后也能被激活，那么，我們有理由假設(shè)，成年大鼠在BFD后也可能造成MD所引起的眼優(yōu)勢(shì)移動(dòng)，而其機(jī)制可能在于調(diào)節(jié)視皮層抑制性和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體的重新表達(dá)和分布，最終導(dǎo)致抑制性神經(jīng)通路和興奮性神經(jīng)通路傳遞的失平衡，從而再激活成年視皮層可塑性。本研究擬為成年弱視的治療提供新的思路。 為此，本研究采用了以下技術(shù)和方法，探討成年Long-Evans大鼠在BFD后，視皮層可塑性再激活的可能機(jī)制。 1.采用視覺誘發(fā)電位(vi

7、sualevokedpotentials，VEPs)記錄方法驗(yàn)證Long-Evans大鼠視皮層可塑性關(guān)鍵期結(jié)束的時(shí)間，然后采用成年大鼠進(jìn)行BFD，最后選擇短期MD就能引起眼優(yōu)勢(shì)移動(dòng)的BFD時(shí)間。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)： (1)正常幼年大鼠(小于等于P5W)對(duì)MD的反應(yīng)表現(xiàn)為被剝奪眼反應(yīng)的早期減弱和非剝奪眼反應(yīng)的緩慢增強(qiáng)；短期(3天)MD就能造成幼年大鼠視皮層眼優(yōu)勢(shì)移動(dòng)。 (2)MD不能造成正常成年大鼠(大于P6W)雙眼反應(yīng)的

8、明顯改變，也不能造成其眼優(yōu)勢(shì)移動(dòng)。 (3)BFD14天后的成年大鼠視皮層眼優(yōu)勢(shì)可在短期(3天)MD后發(fā)生移動(dòng)，說(shuō)明BFD14天組模型可以穩(wěn)定地激活成年大鼠視皮層可塑性；BFD14天后的成年大鼠對(duì)MD的反應(yīng)也表現(xiàn)為被剝奪眼反應(yīng)的早期減弱和非剝奪眼反應(yīng)的緩慢增強(qiáng)，類似于幼年大鼠對(duì)MD的反應(yīng)。 (4)因此在以下兩部分，本研究均選擇BFD14天P7W大鼠作為成年大鼠雙眼形覺剝奪后視皮層可塑性再激活實(shí)驗(yàn)組模型。 2.采用免

9、疫組化染色和免疫印跡技術(shù)，對(duì)P1W-P9W正常大鼠和P7WBFD14天模型大鼠的視皮層中抑制性和興奮性遞質(zhì)受體亞型分別進(jìn)行標(biāo)記和檢測(cè)，探索大鼠視皮層中抑制性和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體表達(dá)的發(fā)育特征以及BFD對(duì)成年視皮層內(nèi)抑制性和興奮性遞質(zhì)受體亞型表達(dá)和分布的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： (1)GABAAα1主要分布在視皮層Ⅱ-Ⅲ層和Ⅳ層，其在未睜眼時(shí)(P1W)少量表達(dá)，自睜眼后視皮層可塑性關(guān)鍵期高峰(P3W)時(shí)，表達(dá)明顯增強(qiáng)，到可塑性關(guān)鍵期結(jié)束時(shí)

10、(P5W)到高峰，至成年期(P7W)保持高水平表達(dá)，而BFD14天造成了成年大鼠視皮層GABAAα1陽(yáng)性表達(dá)的減弱。 (2)NMDA-NR2A主要分布在視皮層Ⅱ-Ⅲ層，其在未睜眼時(shí)少量表達(dá)，可塑性關(guān)鍵期高峰時(shí)最明顯，之后表達(dá)減少至成年期維持一定水平，而BFD14天可以造成成年大鼠視皮層NMDA-NR2A陽(yáng)性表達(dá)的減弱。 (3)NMDA-NR2B在未睜眼時(shí)表達(dá)較明顯，可塑性關(guān)鍵期高峰時(shí)表達(dá)最多，之后表達(dá)下降穩(wěn)定在成年期低水

11、平，而BFD14天可以造成成年大鼠視皮層NMDA-NR2B表達(dá)增強(qiáng)。 (4)GluR-1平均分布在視皮層各層，在出生后少量表達(dá)，之后隨年齡增長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，其表達(dá)在可塑性關(guān)鍵期終止時(shí)達(dá)到高峰并在成年期維持較高水平，而BFD14天對(duì)成年大鼠視皮層GluR-1陽(yáng)性表達(dá)沒有影響。 3.采用視皮層腦片膜片鉗全細(xì)胞記錄和電流分離技術(shù)，分別記錄P1W-P9W正常大鼠和P7WBFD14天大鼠視皮層神經(jīng)元膜學(xué)特性、突觸后電流、GABAA抑制

12、性突觸后電流(GABAA-IPSCs)與NMDA興奮性突觸后電流(NMDA-EPSCs)，探討視皮層神經(jīng)元遞質(zhì)通路變化的發(fā)育特性以及BFD對(duì)成年大鼠視皮層神經(jīng)元突觸傳遞特性的影響。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)： (1)從睜眼前到視皮層發(fā)育可塑性關(guān)鍵期高峰，視皮層Ⅱ-Ⅲ層神經(jīng)元的電學(xué)成熟度以及突觸功能逐漸成熟，到關(guān)鍵期結(jié)束時(shí)基本穩(wěn)定接近成年水平，提示視皮層Ⅱ-Ⅲ層神經(jīng)元的電學(xué)成熟度以及突觸功能是視覺經(jīng)驗(yàn)依賴性的。而BFD不改變成年大鼠視皮層

13、神經(jīng)元的膜學(xué)特性和PSCs電學(xué)指標(biāo)。 (2)GABAA-IPSCs峰值隨年齡的增長(zhǎng)逐漸增大，在可塑性關(guān)鍵期結(jié)束時(shí)達(dá)到高峰，之后在成年期維持高水平，說(shuō)明其峰值變化是視覺經(jīng)驗(yàn)依賴性的，并且GABAA-IPSCs的復(fù)極化時(shí)間隨著神經(jīng)元的成熟也經(jīng)歷了從短到長(zhǎng)的變化過(guò)程。BFD減弱了成年大鼠視皮層神經(jīng)元GABAA-IPSCs的峰值，但對(duì)其復(fù)極化的時(shí)間沒有影響。 (3)NMDA-EPSCs峰值和NMDA-EPSCs在總EPSCs中所

14、占比例在可塑性關(guān)鍵期高峰時(shí)占優(yōu)勢(shì)，之后便降低維持在一定成年期低水平，說(shuō)明其發(fā)育變化是視覺經(jīng)驗(yàn)依賴性的，但BFD對(duì)成年大鼠視皮層神經(jīng)元EPSCs、NMDA-EPSCs的峰值、以及NMDA-EPSCs在總EPSCs中所占比例沒有明顯影響。NMDA-EPSCs復(fù)極化時(shí)間隨著發(fā)育是逐漸縮短的，這與NMDA受體亞型的發(fā)育變化有關(guān)，是視覺經(jīng)驗(yàn)依賴性的，而BFD不影響成年大鼠視皮層神經(jīng)元NMDA-EPSCs的復(fù)極化時(shí)間。 本研究得到以下結(jié)論：

15、 1、BFD可成功再激活成年大鼠視皮層可塑性，形覺剝奪和光覺剝奪一樣可以終身增強(qiáng)其眼優(yōu)勢(shì)可塑性。 2、成年大鼠BFD后，視皮層GABAAα1受體表達(dá)的減少和其介導(dǎo)的GABA能抑制性神經(jīng)回路強(qiáng)度的減弱可能是成年大鼠視皮層重新進(jìn)入關(guān)鍵期的鑰匙，是成年大鼠視皮層可塑性再激活的重要分子機(jī)制。 3、成年大鼠在BFD后可誘導(dǎo)出MD所引起的眼優(yōu)勢(shì)移動(dòng)，其機(jī)制可能在于調(diào)節(jié)視皮層抑制性和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體的重新表達(dá)和分布，最終導(dǎo)致