蘇云金芽孢桿菌cyt2Ba7基因的研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)殺蟲(chóng)晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)中的Cyt2Ba7蛋白是一種殺蚊毒蛋白,它在Bt中表達(dá)量不高并且不形成晶體,因而難于純化并進(jìn)行生物活性的研究.該研究將cyt2Ba7基因克隆到表達(dá)載體pQE30,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)M15進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和純化.純化的Cyt2Ba7蛋白對(duì)于Sf9細(xì)胞具有溶細(xì)胞活

2、性,對(duì)致倦庫(kù)蚊(Culex quinquefasciatus)三齡幼蟲(chóng)的半致死濃度(LC<,50>)為1.95μg/ml.此外,為了研究Cyt2Ba7蛋白C末端15個(gè)氨基酸的功能,我們將缺失這段氨基酸編碼序列的cyt2Ba7基因在E.coli中進(jìn)行表達(dá)、純化和生物活性測(cè)定.結(jié)果顯示缺失了C末端序列的Cyt2Ba7蛋白在溶細(xì)胞活性和殺蚊毒力等方面與全長(zhǎng)的Cyt2Ba7蛋白相類似,但它的表達(dá)對(duì)E.coli宿主具有致死效應(yīng).由此可見(jiàn)該蛋白C末

3、端序列可以保護(hù)宿主不受Cyt2蛋白毒性的影響,這可能是導(dǎo)致Cyt1與Cyta蛋白性質(zhì)差異的一個(gè)重要原因.為了提高Cyt2Ba7蛋白在Bt中的表達(dá)量,我們將cyt2Ba7基因與分子伴侶p20基因串聯(lián),構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pHP20C并經(jīng)電激轉(zhuǎn)化Bt無(wú)晶體菌株4Q7,結(jié)果顯示Cyt2Ba7蛋白的表達(dá)量提高了1.6倍,而且形成了具有不規(guī)則形狀的蛋白晶體.免疫與配體印跡實(shí)驗(yàn)證明,P20與Cyt2Ba7蛋白之間存在著相互結(jié)合的作用.這是首次發(fā)現(xiàn)P20具