硬骨魚類膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(gdnf)的分離鑒定、表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、精原干細(xì)胞（SSCs）是雄性動(dòng)物體內(nèi)唯一能向子代傳遞遺傳信息的成體干細(xì)胞，其增殖與分化的每個(gè)環(huán)節(jié)都可能影響生物個(gè)體的生殖能力或育性，潛在的生物學(xué)意義使其成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)。大量研究證實(shí)，膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，gdnf）是介導(dǎo)哺乳類（特別是嚙齒類） SSCs自我更新與維持的關(guān)鍵因素，同時(shí)也是體外細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的必需因子。在硬骨魚類，gdnf目前僅在虹鱒

2、（Oncorhyncus mykiss）中進(jìn)行了分離鑒定，其mRNA表達(dá)于精巢生殖細(xì)胞，并且mRNA表達(dá)水平與SSCs的自我更新過(guò)程密切相關(guān)，提示在非哺乳類動(dòng)物中Gdnf可能同樣介導(dǎo)了SSCs的自我更新與維持，但具體如何，尚待研究。
　　另一方面，不少研究者通過(guò)在培養(yǎng)基中添加多種生長(zhǎng)因子如堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、白血病抑制因子（Lif）、Gdnf以及魚血清、胚胎提取物等，進(jìn)行了魚類SSCs體外培養(yǎng)的相關(guān)研究，但除青鳉（Or

3、yzias latipes）外，目前僅建立了短期或原代SSC培養(yǎng)體系。Hong等用含魚血清、自身胚胎提取物、人重組bFGF的條件培養(yǎng)基成功建立了一株成年青鳉精巢細(xì)胞來(lái)源的精原干細(xì)胞系SG3，同時(shí)也是迄今唯一的硬骨魚類SSC細(xì)胞系，SG3表達(dá)多個(gè)生殖細(xì)胞特異分子如dazl、piwi、vasa，在培養(yǎng)體系中能完成整個(gè)減數(shù)分裂過(guò)程，并產(chǎn)生有活力的精子。目前。SG3在體外培養(yǎng)已達(dá)140代以上，依然能穩(wěn)定增殖。遺憾的是，Gdnf是否介導(dǎo)了SG3的

4、自我更新與維持，目前尚不清楚。
　　鑒于此，本研究以青鳉、羅非魚（在本研究中如未特殊說(shuō)明，均指尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus））為研究對(duì)象，主要開展了以下兩方面工作：一是獲得并鑒定了青鳉與羅非魚gdnf的cDNA序列，并對(duì)其在胚胎發(fā)育不同時(shí)期及不同組織中的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)；二是構(gòu)建pET30a原核表達(dá)載體，獲得了純化的Gdnf重組蛋白，通過(guò)EdU標(biāo)記、CCK-8與定量PCR檢測(cè)，結(jié)果表明Gdnf重

5、組蛋白能促進(jìn)SG3的增殖，并上調(diào)bcl6b的表達(dá)。具體結(jié)果如下：
　　1. gdnf的cDNA序列與分析
　　經(jīng)RT-PCR、測(cè)序分析，分別從青鳉、羅非魚成功獲得了具有2種不同基因編碼的gdnf cDNA序列，分別命名為Olgdnfa與Olgdnfb；Ongdnfa與Ongdnfb。Olgdnfa與Olgdnfb分別編碼253、245個(gè)氨基酸；Ongdnfa與Ongdnfb分別編碼257、271個(gè)氨基酸。Gdnfa/b通過(guò)蛋

6、白酶的水解形成成熟蛋白，其C端具有TGF-β家族成員的典型序列特征，即7個(gè)保守的半胱氨酸，成熟蛋白與哺乳類氨基酸一致度達(dá)50％以上，其中TGF-β結(jié)構(gòu)域高達(dá)65%以上，提示Gdnfa/b在不同物種中可能均具有保守的生物學(xué)功能。氨基酸一致度、基因共線性及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果均表明，青鳉、羅非魚gdnfa與哺乳類具有更近的親緣關(guān)系。
　　2. gdnf在胚胎發(fā)育不同時(shí)期及各組織中的mRNA表達(dá)
　　RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，青鳉、羅

7、非魚gdnfa與b均表達(dá)于胚胎發(fā)育不同時(shí)期，及包括精巢在內(nèi)的多種組織。在青鳉中，除眼外，gdnfa在各組織表達(dá)水平均高于gdnfb；在羅非魚中，gdnfa在各組織均有較高水平的表達(dá)，gdnfb在垂體、鰓、肝臟和頭腎表達(dá)較高，在其他組織表達(dá)水平較低。
　　3青鳉gdnfa與b的原核表達(dá)、純化
　　成功構(gòu)建了青鳉 gdnfa與 b的含 His標(biāo)簽的原核重組表達(dá)載體，即pET30a-Olgdnfa與pET30a-Olgdnfb，轉(zhuǎn)

8、化BL21(DE3)表達(dá)菌株，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)OlGdnfa/b蛋白，之后通過(guò)親和層析(Ni-IDA樹脂)進(jìn)行純化，獲得了OlGdnfa/b重組蛋白，其純度大于85%。
　　4青鳉Gdnfa與b的生物學(xué)活性
　　(1)用分別含1、10、50 ng/ml青鳉Gdnfa與b的DMEM條件培養(yǎng)基（含L-glutamine(2 mM)。Na-pyruvate(1 mM)。Na-selenite(2 nM)。non-essenti

9、al amino acids(1 mM)、2-mercaptoethanol(50 PM)，命名為5N）培養(yǎng)SG3于96孔板，對(duì)照組為不含Gdnf的5N培養(yǎng)基，分別于1、4、5、6 d后，用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，結(jié)果顯示1、10、50 ng/ml Gdnfa與 b均能促進(jìn)SG3細(xì)胞增殖；此外，用EdU標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，含有Gdnf的5N培養(yǎng)基內(nèi)EdU的陽(yáng)性細(xì)胞明顯高于對(duì)照（p<0.05)。從而表明，Gdnfa與 b均能

10、促進(jìn)SG3細(xì)胞增殖。
　　(2)用5N培養(yǎng)基培養(yǎng)SG318 h后，分別加入50 ng/ml的青鳉Gdnfa或b，4 h后收集細(xì)胞，半定量RT-PCR檢測(cè)bcl6b與etv5的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示。bcl6b的mRNA水平顯著升高，而etv5的mRNA表達(dá)水平未見明顯變化，qPCR檢測(cè)結(jié)果與此相吻合。bcl6b是哺乳類Gdnf調(diào)控的重要靶基因，在SSCs自我更新與維持中具有重要作用。該研究結(jié)果表明，青鳉Gdnf調(diào)控SSCs自我