貂源H9亞型流感病毒的分離鑒定與血清學調(diào)查.pdf

1、流感病毒的宿主非常廣泛其中高致病性禽流感病毒可跨越禽類感染其它哺乳動物的事件也不斷有內(nèi)部和公開報道，已報道的有貓、虎、獅、美洲豹、石貂、犬、雪貂等哺乳動物感染。目前，除我國外有多個國家和地區(qū)相繼有水貂感染各種亞型流感病毒的情況的報道，例如H3N8、H5N1、H5N3、H7N3、H7N7、H8N4、H11N4等。隨著我國水貂養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，近幾年出現(xiàn)臨床特征主要為咳嗽、體溫升高、呼吸困難、流鼻液的疑似流感病毒感染的癥狀。針對這一現(xiàn)象20

2、13年3月本實驗室對部分水貂的血清進行血清學檢測，發(fā)現(xiàn)其血清中的流感病毒抗體水平較高，但是對該病毒的致病機制和傳播機制尚不清楚。雖然而水貂感染流感病毒的研究和報道少之又少。
　　但是水貂到底能否感染流感病毒和能否在水貂中傳播流感病毒，其主要感染的流感病毒亞型、流感病毒對水貂的致病性及其遺傳演化分析、貂源流感病毒有哪些分子生物學特征等等目前都沒有相關報道證實。針對這一現(xiàn)象本研究主要通過43份疑似病例利用雞胚接種方法分離出2株新型貂源

3、流感病毒并通過RT-PCR基因片段擴增試驗方法確定為H9亞型流感病毒。并對山東地區(qū)的水貂進行隨機抽樣后與分離的新型貂源H9亞型AIV進行流行病學調(diào)查。主要研究內(nèi)容如下:
　　1、本研究通過雞胚接種方法進行病毒的分離，主要方法是從43份水貂肺組織疑似病料中通過研磨肺組織后取上清液接種于9-11日齡的SPF雞胚培養(yǎng)3日后發(fā)現(xiàn)部分雞胚有頭部或全身出血現(xiàn)象，收取有血凝效價的尿囊液后于-20℃保存提純后，結果獲得2株流感病毒病毒，分別命名為

4、A/mink/Shandong/F6/2013、A/mink/Shandong/F10/2013。
　　2、本研究通過RT-PCR方法對兩株分離株的HA基因進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后進行Blast。結果表明這兩株HA片段的基因序列所與甲型禽流感病毒H9亞型(A/chicken/Henan/HF/2012、A/chicken/Rizhao/853/2013)同源性最高，并具有一系列H9 AIV特征性遺傳位點。
　　3、分離株H

5、A基因片段的核酸序列分析結果所示經(jīng)過HA基因片段核酸序列的分析發(fā)現(xiàn)這兩株病毒的的HA基因序列相同，為同一病毒?；蛐蛄蟹治霰砻鰽/mink/Shandong/F6/2013和A/mink/Shandong/F10/2013的HA基因片段與GenBank中收錄的H9亞型AIV參考毒株的HA基因片段同源性在96.3％～97.9％之間。其中兩株分離株的同源性為100％，與A/chicken/zhejiang/FSQ/2011和A/chicke

6、n/zhejiang/329/2011同源性最高為97.9％。
　　4、通過氨基酸序列分析結果表明分離株HA基因編碼561個氨基酸，與A/ehicken/zhejiang/329/2011氨基酸序列同源性達到98.7％;蛋白裂解位點為PQ↓VPSRSSR，從分子水平推論，屬于非高致病性毒株;分離株HA蛋白受體結合位點沒有發(fā)生較大變異。
　　5、系統(tǒng)發(fā)生分析表明:新型貂源H9N2亞型流感病毒為禽流感病毒重組病毒，在經(jīng)過了多年的

7、進化發(fā)展之后部分基因發(fā)生了突變從而獲得了可以感染水貂能力。分離株A/mink/Shandong/F6/2013和A/mink/Shandong/F10/2013系同一起源，分離株HA基因與A/chicken/Shanghai/20/2013和A/chicken/zhejiang/329/2011親緣關系最近。
　　6、本研究通過血清學方法進行貂源禽流感病毒的流行病學調(diào)查，旨在確定水貂中是否存在感染新型貂源AIV的感染現(xiàn)象。本次研究

8、中我們通過采集175份水貂血清對其進行新型貂源H9亞型AIV的血凝抑制實驗檢測，結果發(fā)現(xiàn)血清中發(fā)生血凝抑制反應有70份，占40％。初步說明山東地區(qū)部分水貂存在感染新型貂源H9亞型AIV現(xiàn)象。
　　本研究為流感病毒H9亞型在水貂種內(nèi)的傳播及流行提供科學數(shù)據(jù)和理論依據(jù)，對初步了解山東地區(qū)水貂養(yǎng)殖生產(chǎn)中對于流感病毒的感染類型和感染率提供具體地數(shù)據(jù)。從而在水貂的日常飼養(yǎng)管理中對于流感病毒的流行能夠做好針對性的預防工作，如水貂源流感病毒疫苗