家蠶絲腺高表達基因BmeIF5A、BmCyPA的克隆與分析.pdf

1、利用生物基因組進化中的保守性，具有某一功能的基因在不同物種之間常具有一定的同源性，有目的的克隆基因家族新成員，已經(jīng)成為新基因克隆的有效策略。同時，結(jié)合基因表達序列標(biāo)簽進行基因表達分析，對于發(fā)現(xiàn)組織特異表達基因具有重要指導(dǎo)作用。家蠶絲腺是合成和分泌絲蛋白的主要器官，是所有生物中最具活力的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的代表，也是理想的生物模型。本論文研究分為三個方面：第一、二兩方面利用同源策略和家蠶EST數(shù)據(jù)，分別從家蠶絲腺克隆得到新的家蠶真核生物翻譯啟

2、始因子BmeIF5A和親環(huán)蛋白基因BmCyPA，并進行了功能和結(jié)構(gòu)的初步研究；第三方面在全基因組水平對家蠶親環(huán)蛋白基因家族進行了結(jié)構(gòu)和功能分析。 家蠶BmeIF5A基因具有3個外顯子2個內(nèi)含子，推導(dǎo)開放閱讀框由160個氨基酸組成，編碼分子量為17.5kD，等電點為5.16的蛋白。該基因編碼的蛋白質(zhì)具有保守的hypusine修飾區(qū)域，與其他物種來源的42個eIF5A基因進行系統(tǒng)發(fā)生分析，結(jié)果表明eIF5A基因在系統(tǒng)發(fā)生樹中同一物種

3、聚在一起，物種之間分群，家蠶BmeIF5A基因表現(xiàn)出高度的序列保守性，在進化上與親緣關(guān)系接近的幾種昆蟲分為一枝。3'RACE研究發(fā)現(xiàn)另一具有不同3'UTR的基因BmeIF5A-2，與BmeIF5A具有相同的編碼區(qū)序列，表明家蠶eIF5A基因具有兩種剪接形式。家蠶7組織中的表達譜分析顯示，BmeIF5A基因以絲腺表達豐度最高，與EST數(shù)據(jù)一致。分析表明BmeIF5A的高表達豐度可能與絲蛋白起始合成有關(guān)，并且可能影響絲腺細胞存活。

4、家蠶BmCyPA基因由2個外顯子1個內(nèi)含子組成，推導(dǎo)開放閱讀框編碼由165個氨基酸組成，編碼分子量為19.4kD，等電點為8.79的蛋白。3'RACE研究得到近全長的序列。序列分析表明家蠶BmCyPA基因具有高度的保守性，具有與CsA側(cè)鏈結(jié)合的氨基酸及肽酰脯氨酸順反異構(gòu)酶活性位點，表明可能具有肽酰脯氨酸順反異構(gòu)酶活性和與CsA結(jié)合特性。CyP基因在系統(tǒng)發(fā)生上首先按照基因定位分為兩群，各群里同一物種聚在一起，在進化上家蠶BmCyPA與昆蟲

5、分為一小枝。家蠶7組織中的表達譜分析顯示，BmCyPA在絲腺高豐度表達，與EST數(shù)據(jù)一致。分析提示BmCyPA基因在絲腺高豐度表達可能對絲蛋白在折疊的啟始過程中形成有活性的空間結(jié)構(gòu)非常必要，進而影響絲蛋白分泌效率。 家蠶親環(huán)蛋白(CyP)基因家族在全基因組水平由18條相似序列組成。我們從中克隆得到了新的重要基因BmCyPB，7組織表達譜分析顯示在中腸、脂肪體兩組織特異表達。CyP基因系統(tǒng)發(fā)生分析顯示CyP家族基因按照基因定位分為

6、兩個群，家蠶BmCyPA、BmCyPB分別位于兩個群。家蠶CyP基因家族與人CyPA在氨基酸序列上具有較高的同源性。結(jié)構(gòu)域分析顯示家蠶CyP基因家族可分為SD和MD兩類，無根進化樹將18個家族基因分為兩枝。我們根據(jù)功能元件相似性預(yù)測了SD和MD基因的功能，同樣預(yù)測了線粒體cyclophilin基因的功能。還通過序列氨基酸位點的置換、缺失和插入分析推測位于胞質(zhì)cyclophilin基因的功能差異，這些功能差異使蛋白質(zhì)在三維結(jié)構(gòu)上發(fā)生或小或