生物化學(xué)論文 宋偉杰

1、<p>　　新型核酸分子熒光探針-分子信標(biāo)的研究進(jìn)展</p><p>　　山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 宋偉杰 </p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　分子信標(biāo)是一種設(shè)計(jì)巧妙的新型熒光標(biāo)記核酸探針。它的最初設(shè)計(jì)是用來(lái)檢測(cè)核酸，但是由于分子信標(biāo)是特殊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)成的，因此具有很強(qiáng)的特異性識(shí)別靶標(biāo)序列的能力。分

2、子信標(biāo)對(duì)靶分子的檢測(cè)具有高靈敏度、強(qiáng)選擇性和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等多種優(yōu)點(diǎn)。因此，它在多重SNP測(cè)定和細(xì)胞內(nèi)病毒表達(dá)等核酸檢測(cè)及其多種DNA-蛋白質(zhì)，DNA-DNA損傷等生物化學(xué)分析、生物醫(yī)學(xué)研究及環(huán)境監(jiān)測(cè)等各大領(lǐng)域發(fā)揮著重大作用。</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　1996年Tyagi和Kramer等人設(shè)計(jì)了一種可以特異性識(shí)別核酸序列的新型熒光探針。

3、分子信標(biāo)是由特殊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)成的，因此具有很強(qiáng)的特異性識(shí)別靶標(biāo)序列的能力[1]]。分子信標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)很多，如高靈敏性，強(qiáng)選擇性及特別適用于活體實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)功能。因此，其能夠得到飛速發(fā)展。分子信標(biāo)在生物化學(xué)分析、生物醫(yī)藥學(xué)研究等各大領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。并且隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新型分子信標(biāo)也將得到不斷的發(fā)展與進(jìn)步，分子信標(biāo)的應(yīng)用領(lǐng)域也會(huì)不斷拓展。</p><p>　　1 分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)及作用原理</p>&l

4、t;p>　　1.1 分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)</p><p>　　分子信標(biāo)是通過(guò)熒光標(biāo)記而形成的。分子信標(biāo)一般分為兩種:一種是包含了環(huán)-莖兩部分結(jié)構(gòu)的單鏈寡核苷酸組成的，它的形狀類似發(fā)夾型。另一種是無(wú)莖的，不含有雙鏈結(jié)構(gòu)的莖桿區(qū)，只含有單鏈的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。環(huán)-莖型寡聚核苷酸序列的環(huán)上的寡聚核苷酸序列是分子信標(biāo)的基因識(shí)別部分，一般含有15-30堿基序列。作為環(huán)狀部分能夠與靶基因自發(fā)進(jìn)行雜交。莖區(qū)一般長(zhǎng)度為5-12堿基互補(bǔ)序

5、列，莖區(qū)是一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，莖區(qū)兩端分別連接有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)。一般來(lái)說(shuō)，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)都是一些有機(jī)基團(tuán)。在分子信標(biāo)的5'端和3'端通過(guò)連接臂連接上了熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)。無(wú)莖分子信標(biāo)具有良好的柔韌性并且其結(jié)構(gòu)如同一個(gè)閉環(huán)結(jié)構(gòu)，當(dāng)分子信標(biāo)與靶序列特異性結(jié)合之后，探針與靶標(biāo)形成的雙鏈具有剛性結(jié)構(gòu)從而使得熒光分子和猝滅分子分開，熒光恢復(fù)。</p><p>　　1.2 分子信標(biāo)的作用原理</p&

6、gt;<p>　　在自由狀態(tài)下，分子信標(biāo)未與靶分子進(jìn)行特異性結(jié)合，由于莖桿區(qū)互補(bǔ)序列的結(jié)合使得探針分子形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)從而成為發(fā)夾探針。在自由狀態(tài)下，由于莖部分兩列互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵連接，使得熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)距離很近，熒光基團(tuán)將能量轉(zhuǎn)移給猝滅基團(tuán)而發(fā)生熒光猝滅。有很多研究發(fā)現(xiàn)納米金的猝滅效率更高，幾乎能接近 100%[2,3,4]當(dāng)分子信標(biāo)與序列完全互補(bǔ)的靶標(biāo)分子結(jié)合形成的鏈雜交體時(shí)，信標(biāo)莖桿互補(bǔ)區(qū)被拉開，熒光分子和猝滅分

7、子之間的距離逐漸增大。根據(jù)Foerster理論，中心熒光能量轉(zhuǎn)移效率與兩者之間距離的6次方成正比[5]。雜交之后，分子信標(biāo)的熒光幾乎完全恢復(fù)。并且熒光強(qiáng)度與溶液中靶標(biāo)序列的量成正比，所以可以用來(lái)作定量分析。當(dāng)然，在高溫、高pH、DNA損傷等條件下會(huì)使分子信標(biāo)的熒光信號(hào)增強(qiáng)，這也就決定分子信標(biāo)的多用途性。無(wú)莖分子信標(biāo)不含有與靶標(biāo)無(wú)關(guān)的序列，設(shè)計(jì)和合成上相當(dāng)簡(jiǎn)單，成本降低。由于二甲氨基偶氮苯甲酰（DABSYL）和黑洞猝滅劑（BHQ-2）對(duì)多

8、種發(fā)射光譜不同的熒光基團(tuán)都有很好的淬滅作用，在量子點(diǎn)分子信標(biāo)中，也經(jīng)常使用這兩種猝滅基團(tuán)[6,7]。無(wú)莖分子信標(biāo)還具有響應(yīng)快、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。但是由于其</p><p>　　2 分子信標(biāo)的應(yīng)用</p><p>　　2.1用于核酸檢測(cè)分析</p><p>　　2.1.1實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定靶標(biāo)的濃度</p><p>　　在PCR反應(yīng)體系中加入擴(kuò)

9、增靶標(biāo)序列互補(bǔ)的分子信標(biāo)，然后用熒光ABI PRISM 7000型PCR監(jiān)督，測(cè)定其擴(kuò)增循環(huán)-熒光曲線。這樣對(duì)于那些多余的分子信標(biāo)無(wú)需分離。并且還能夠?qū)崟r(shí)定量的測(cè)定其擴(kuò)增靶標(biāo)的量。分子信標(biāo)作為實(shí)時(shí)熒光探針是非常適合的。目前，分子信標(biāo)已經(jīng)成功的應(yīng)用于各種病原體核酸的檢測(cè)。作為一種新型的檢測(cè)手段，其具有很多常規(guī)方法所不具有的優(yōu)點(diǎn)。測(cè)定時(shí)具有很高的靈敏度和特異性。操作簡(jiǎn)單易行、可避免污染。能夠?qū)崟r(shí)的檢測(cè)[14-16]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，把

10、分子信標(biāo)探針與PCR技術(shù)相結(jié)合來(lái)監(jiān)測(cè)的報(bào)告越來(lái)越多。例如，對(duì)果汁和牛奶中大腸桿菌0157、H7的檢測(cè)[17]；對(duì)沙門氏桿菌的半自動(dòng)快速檢測(cè)；對(duì)人體肺癌細(xì)胞中骨形成的蛋白質(zhì)受體mRNA的識(shí)別檢測(cè)；對(duì)細(xì)菌人工染色體克隆的檢定；對(duì)HIV-1的定量分析；Y染色體的精確測(cè)定等。</p><p>　　2.1.2 活體細(xì)胞中的RNA的測(cè)定</p><p>　　能夠?qū)崟r(shí)的對(duì)細(xì)胞體內(nèi)的mRNA表達(dá)進(jìn)行有

11、效的檢測(cè)將在疾病診斷、藥物研發(fā)及分子生物學(xué)等各個(gè)方面發(fā)揮重大作用。然而在生物學(xué)以及近年來(lái)的反義核酸研究中，對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的mRNA與反義寡核酸鏈之間的雜交進(jìn)行描述也是一大難題。但是分子信標(biāo)的使用卻解決了重大難題。</p><p>　　傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是傳統(tǒng)脂質(zhì)體或小分子量到引物導(dǎo)入分子信標(biāo)，這種方法低效、進(jìn)入細(xì)胞時(shí)間很長(zhǎng)并且經(jīng)常對(duì)分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)造成破壞。Nitin等人利用分子信標(biāo)的環(huán)柄結(jié)構(gòu)及熒光特點(diǎn)，在分子信標(biāo)的一端連接

12、TAT肽段，由此使得分子信標(biāo)能夠主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞、發(fā)射熒光和雜交。Matsuo等人利用分子信標(biāo)研究了BFGF mRNA在細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程[18]。其主要方法是設(shè)計(jì)并合成了與待測(cè)目標(biāo)mRNA序列互補(bǔ)的分子信標(biāo)和對(duì)照組細(xì)胞的熒光會(huì)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增強(qiáng)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究可得，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的核酸酶會(huì)水解分子信標(biāo)，從而使得結(jié)構(gòu)遭到破壞而產(chǎn)生熒光。PNA分子信標(biāo)能夠有效避免核酸酶的水解，從而使得熒光強(qiáng)度準(zhǔn)確反應(yīng)活體mRNA的代謝[19]。Sokol等利用為

13、注射方法檢測(cè)到了人類白血病細(xì)胞K562中RNA與分子信標(biāo)的雜交。Perlette等人也利用微注射法引入分子信標(biāo)，對(duì)單個(gè)活細(xì)胞中的RNA進(jìn)行了檢測(cè)，并利用ICCD成像系統(tǒng)得到了一系列反應(yīng)分子信標(biāo)與RNA結(jié)合的熒光圖像。針對(duì)于細(xì)胞內(nèi)核酶降解而產(chǎn)生的假陽(yáng)性信號(hào)，Gang Bao等人設(shè)計(jì)了雙重PRET分子信標(biāo)用于活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)mRNA。Weihong Tan等提出了在分子信標(biāo)干部位</p><p>　　2.1.3 利用

14、多色分子信標(biāo)分析基因突變</p><p>　　基因突變是人體發(fā)病的重要原因，對(duì)于基因突變的預(yù)防診斷和治療顯得尤為重要。傳統(tǒng)的基因變異檢測(cè)方法通常是通過(guò)很多重復(fù)的移液、離心、培養(yǎng)、等步驟。過(guò)程十分復(fù)雜，并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此探索一種方便快捷的檢測(cè)方法將為基因突變檢測(cè)的發(fā)展起到巨大的推動(dòng)作用。通過(guò)利用多色分子信標(biāo)進(jìn)行基因突變檢測(cè)，使得過(guò)程更加簡(jiǎn)單、快速并且更加靈敏。這種方法同時(shí)推動(dòng)了醫(yī)學(xué)中對(duì)疾病機(jī)理研究和治療的快速發(fā)展。

15、Kostrikis等建立了基因光譜分型檢測(cè)技術(shù)，對(duì)HIV輔助受體CCR5等位基因的突變進(jìn)行檢測(cè)。Maarten等和Belinda等分別對(duì)亞甲四氫葉酸還原酶的基因進(jìn)行了研究。復(fù)合聚合酶鏈反應(yīng)(復(fù)合PCR)-膜芯片斑點(diǎn)雜交、聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)方法、測(cè)序等[22]。亞甲四氫葉酸還原酶的某些基因變異和許多心血管疾病以及神經(jīng)管缺陷疾病的發(fā)病有關(guān)。此種標(biāo)記存在著許多優(yōu)點(diǎn)。如果對(duì)不同分子信標(biāo)探針修飾以具有不同特征發(fā)射波長(zhǎng)

16、的熒光發(fā)射基團(tuán)，可在同一激光下，通過(guò)檢測(cè)這些特征波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)在統(tǒng)一體系中的多基因分析。分子信標(biāo)和線性寡核苷酸探針相比較而言，分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)檢測(cè)特異性更高，對(duì)于靶序列中單個(gè)</p><p>　　2.2 用于蛋白質(zhì)和DNA的檢測(cè)分析</p><p>　　根據(jù)目前對(duì)于蛋白質(zhì)和DNA的分別檢測(cè)及對(duì)于其之間的相互作用檢測(cè)將在現(xiàn)代生物科學(xué)中具有非常廣闊的前景，但是也是具有巨大挑戰(zhàn)的

17、課題之一。人們對(duì)于蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)中，運(yùn)用了分子信標(biāo)與蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合時(shí)，發(fā)現(xiàn)其熒光強(qiáng)度也會(huì)增加，由此說(shuō)明分子信標(biāo)對(duì)于蛋白質(zhì)也是具有一定的識(shí)別能力的。分子信標(biāo)與核酸識(shí)體進(jìn)行有機(jī)結(jié)合從而得到組合體叫做分子識(shí)體。分子信標(biāo)識(shí)體的結(jié)構(gòu)一般來(lái)說(shuō)是一種單鏈的DNA或RNA分子，通常含有25-60個(gè)核苷。目前在蛋白質(zhì)檢測(cè)中運(yùn)用分子信標(biāo)識(shí)體主要應(yīng)用于凝血酶檢測(cè)。另外還有一種是基于檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)合過(guò)程中的各向異性熒光變化。這種探針是由單熒光基團(tuán)標(biāo)記的識(shí)體構(gòu)成的

18、。</p><p>　　另外重要的研究是分子信標(biāo)應(yīng)用于研究DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用對(duì)于大多數(shù)生物的影響十分顯著。分子信標(biāo)的使用對(duì)于研究DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用具有重要作用，并且從而使得人們更加深入的了解DNA-蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系。人們?cè)谘芯颗c探索DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)主要使用了交聯(lián)技術(shù)、過(guò)濾結(jié)合技術(shù)、DNA足跡法、凝膠阻滯分析、圓二色性光譜、親和色譜、X射

19、線晶體衍射、熒光光譜分析等方法與技術(shù)。從而得到了大量關(guān)于DNA-蛋白質(zhì)兩者之間的相互作用的信息：如，結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合區(qū)的長(zhǎng)度和特異性等。Li等研究了分子信標(biāo)和SSB結(jié)合的摩爾比和結(jié)合常數(shù)。Fang等還研究了乳酸酶（LDH）與分子信標(biāo)DNA的相互作用。實(shí)驗(yàn)表明，分子信標(biāo)能夠有效的應(yīng)用于DNA-蛋白質(zhì)之間的定量分析檢測(cè)及核酸與蛋白質(zhì)的相互作用研究。</p><p>　　2.3 分子信標(biāo)在DNA生物傳感器中的應(yīng)用<

20、/p><p>　　DNA生物傳感器是一種能夠?qū)⒛康腄NA的存在轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測(cè)的電、光、聲等信號(hào)的傳感裝置。DNA生物傳感器和其它的傳感器一樣，包含兩個(gè)部分：即分子識(shí)別原件（DNA）和轉(zhuǎn)換器。原理實(shí)在是在電極上固定一條含有十幾到上千個(gè)核苷酸的單鏈DNA（ssDNA），通過(guò)DNA分子雜交，對(duì)另一條含有互補(bǔ)的堿基序列的DNA進(jìn)行識(shí)別，結(jié)合成雙鏈DNA（dsDNA）[23]。雜交反應(yīng)在敏感元件上直接完成，換能器能夠?qū)㈦s交過(guò)程中

21、所產(chǎn)生的變化轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。</p><p>　　傳統(tǒng)的DNA轉(zhuǎn)換器所使用的檢測(cè)手段是基于支鏈ss-DNA之間的雜交反應(yīng)進(jìn)行待測(cè)物的檢定[24]。為了進(jìn)一步提高雜交檢測(cè)的特異性和選擇性，1996年Tyagi和Kramer首次建立了分子信標(biāo)探針。分子信標(biāo)能夠特異性檢測(cè)靶序列，并且能夠?qū)⒉煌蛄械亩喾N分子信標(biāo)固定在基片表面，并保持其原有性質(zhì)的不變。</p><p>　　2.4 MB技術(shù)的應(yīng)用

22、</p><p>　　MB是一種設(shè)計(jì)巧妙的新型熒光核酸探針，自1996年Tyagi和Kramer報(bào)道以來(lái)，因其背景信號(hào)低、靈敏性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，使得此技術(shù)在短短的幾年之內(nèi)得到了長(zhǎng)足發(fā)展。一個(gè)傳統(tǒng)的MB是由環(huán)、莖、熒光團(tuán)和猝滅團(tuán)四個(gè)部分組成的。MB與線形探針相比較而言，無(wú)論是選擇性還是從特異性等多個(gè)方面都有其優(yōu)勢(shì)所在，并且為了提高M(jìn)B的選擇性和靈敏度，進(jìn)一步擴(kuò)大MB的應(yīng)用領(lǐng)域，研究者設(shè)計(jì)了不同結(jié)構(gòu)的M

23、B。</p><p>　　Fan等人通過(guò)雜交前后電信號(hào)分子與電極表面的距離不同而引起不同的電信號(hào)對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行檢測(cè)，為電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展奠定了重要的基礎(chǔ)。Immoos等人設(shè)計(jì)了DNA-PEG-DNA式的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。Zhao等[25]用存活蛋白的 MB 檢測(cè)膀胱腫瘤患者尿液沉渣</p><p>　　觀察到存活蛋白陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，提示基于 MB 的特異靶分子檢測(cè)可應(yīng)用于惡性腫瘤早期診斷。L

24、o 等[26]設(shè)計(jì)了能特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞特異表達(dá)的成纖維細(xì)胞激活蛋(fibroblast activation protein, FAP)的分子信標(biāo)。Zheng等[27]巧妙地將MB 與光動(dòng)力治療原理，用光敏劑及其淬滅劑取代經(jīng)典 MB 的熒光基團(tuán)，設(shè)計(jì)了含特異肽片段或堿基序列的光動(dòng)力分子信標(biāo)。利用雜交后電化學(xué)信號(hào)的增加對(duì)互補(bǔ)DNA序列進(jìn)行檢測(cè)。Chen 等[28]設(shè)計(jì)了特異結(jié)合c-raf-1 mRNA的photo-MB[29]。此外，用

25、量子點(diǎn)標(biāo)記的 MB 也能有改善熒光信號(hào)的特異性。</p><p><b>　　3 結(jié)語(yǔ)</b></p><p>　　隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，分子信標(biāo)技術(shù)也得到了飛速發(fā)展。近年來(lái)，分子信標(biāo)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)、基因和生物技術(shù)等重要領(lǐng)域[30-31]。分子信標(biāo)具有特異性高且無(wú)需分離的特點(diǎn)，從而使得其在核酸檢測(cè)中有著很廣泛的作用。在注重功能基因研究的后基因組時(shí)

26、期，分子信標(biāo)將會(huì)被應(yīng)用于基因突變引起的疾病的研究、活細(xì)胞中的RNA的檢測(cè)、蛋白質(zhì)的檢測(cè)及生物芯片等的研究。隨著分子信標(biāo)技術(shù)的發(fā)展和新型分子信標(biāo)的不斷出現(xiàn)，分子信標(biāo)在基因診斷、基因治療等方面發(fā)揮了越來(lái)越重要的作用。</p><p><b>　　4 參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 丁黎娟等.分子信標(biāo)的研究及應(yīng)用[J].科教前沿，2010,21. </p

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