2015年--外文翻譯--惡性瘧原蟲感染易致染色體組不穩(wěn)定和活化誘導(dǎo)胞苷脫氨酶依賴的b細(xì)胞淋巴瘤（譯文）

1、<p><b>　　中文8200字</b></p><p>　　本文出自：Robbiani D F, Stephanie D, Niklas F, et al. Plasmodium Infection Promotes Genomic Instability and AID-Dependent B Cell Lymphoma.[J]. Cell, 2015, 162(4):727

2、-737.</p><p>　　Plasmodium Infection Promotes Genomic Instability and AID-Dependent B Cell Lymphoma</p><p>　　惡性瘧原蟲感染易致染色體組不穩(wěn)定和活化誘導(dǎo)胞苷脫氨酶依賴的B細(xì)胞淋巴瘤</p><p>　　【說(shuō)明：由于本文圖表中的內(nèi)容對(duì)理解整個(gè)實(shí)驗(yàn)有重要作用，因

3、此將圖表的內(nèi)容一同翻譯】</p><p><b>　　簡(jiǎn)圖摘要</b></p><p><b>　　簡(jiǎn)介</b></p><p>　　惡性瘧原蟲所致慢性感染引起分布普遍的染色體組不穩(wěn)定性，并使活化誘導(dǎo)胞苷脫氨酶在GC(Germinal centers，生發(fā)中心)B細(xì)胞中的持續(xù)表達(dá)從而促成成熟B細(xì)胞瘤，這可能解釋了瘧疾和Bu

4、rkitt淋巴瘤病發(fā)之間的聯(lián)系。</p><p><b>　　重點(diǎn)</b></p><p>　　對(duì)體內(nèi)生發(fā)中心的B細(xì)胞染色體易位的捕捉</p><p>　　活化誘導(dǎo)胞苷脫氨酶促進(jìn)了惡性瘧原蟲相關(guān)的B細(xì)胞淋巴瘤</p><p>　　慢性感染導(dǎo)致了向成熟淋巴瘤表型的偏移</p><p>　　惡性瘧原蟲

5、引發(fā)的淋巴瘤存在染色體易位現(xiàn)象其中包括c-MYC/IGH融合基因</p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　50多年前，在流行病學(xué)上惡性瘧原蟲所致慢性感染曾與地方性Burkitt淋巴瘤相關(guān)聯(lián)，后者是一種成熟的B細(xì)胞瘤，以c-myc致癌基因和lgh基因之間的易位為特點(diǎn)。感染是否促進(jìn)了B細(xì)胞瘤、如果如此它的機(jī)制一直都不得而知。為了研究寄生蟲病與淋巴瘤生

6、成之間的關(guān)系，我們使用了夏氏鼠瘧原蟲(Pc)在鼠體內(nèi)產(chǎn)生慢性瘧感染。夏氏鼠瘧原蟲延緩了鼠生發(fā)中心的擴(kuò)增，B細(xì)胞在獨(dú)有的發(fā)育區(qū)內(nèi)經(jīng)歷了迅速的克隆增殖并表達(dá)了活化誘導(dǎo)胞嘧啶核苷脫氨酶(AID)，形成了一個(gè)DNA增變細(xì)胞群。GC B細(xì)胞在Pc感染的過(guò)程中發(fā)生了普遍的DNA破壞，從而導(dǎo)致了染色體的易位。即使感染沒(méi)有改變總體突變率，但是它修飾了淋巴瘤的生成從而促成了AID依賴的成熟B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生并且顯示了染色體的易位。因此，瘧疾感染通過(guò)誘導(dǎo)A

7、ID在GCB細(xì)胞中的持續(xù)表達(dá)促成了成熟B細(xì)胞瘤的發(fā)生。</p><p><b>　　介紹</b></p><p>　　許多病原體和人類腫瘤的發(fā)病都有病因上的牽連，例如，感染EB病毒(又稱人類皰疹病毒4型)、丙肝病毒、HIV、幽門螺桿菌或者惡性瘧原蟲的個(gè)體罹患B細(xì)胞淋巴瘤的風(fēng)險(xiǎn)都比平均水平要高。雖然病毒對(duì)瘤形成有著直接的促進(jìn)作用，這一作用是通過(guò)向靶細(xì)胞傳遞病毒編碼的癌基

8、因來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但是大多數(shù)的病原體和腫瘤發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)依舊模糊不清。比如，地方性的Burkitt淋巴瘤是一種與生發(fā)中心相關(guān)的淋巴瘤，在非洲是最常見(jiàn)的兒童惡性腫瘤，而且該病在惡性瘧原蟲感染地區(qū)的發(fā)病率更高。這種流行病學(xué)的關(guān)聯(lián)在很大程度上沒(méi)有被重視，因?yàn)榈胤叫訠urkitt淋巴瘤細(xì)胞感染的是能使B細(xì)胞腫瘤病變的EB病毒，而人們很少去重視瘧疾在其中的附加作用。</p><p>　　基于組織學(xué)、分子學(xué)和基因表達(dá)分析的方法，人

9、們提出B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞就是攜帶有t(8;14)易位染色體的永生化的GC B細(xì)胞。這種易位將c-myc基因整合到了免疫球蛋白的基因座上從而使c-myc基因的表達(dá)不受控制。不過(guò)不受控制的c-myc基因不能單獨(dú)導(dǎo)致淋巴瘤，它需要編碼蛋白質(zhì)的基因同時(shí)受到損傷，這類基因比如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)和控制細(xì)胞凋亡的p53基因。不論是p53基因突變還是EBV感染都是eBL的特征，它們廣泛的出現(xiàn)在淋巴的惡性病變當(dāng)中。而瘧疾與eBL的聯(lián)系異常緊密。</p

10、><p>　　GC B細(xì)胞是分裂旺盛的細(xì)胞，它們能獨(dú)特的表達(dá)高水平的AID，AID是一種能夠誘導(dǎo)DNA突變的酶，它能使胞嘧啶脫去氨基同時(shí)在lg基因座上產(chǎn)生錯(cuò)配的U:G堿基對(duì)從而引發(fā)體細(xì)胞超突變和抗體的類別轉(zhuǎn)換重組。即使AID對(duì)lg基因座有優(yōu)先的結(jié)合作用，但是并不是完全的lg特異性，它能夠?qū)е旅摪型蛔兒椭掳┗駾NA分子的斷裂，這其中也包括c-myc基因。AID這種非特異性質(zhì)能導(dǎo)致體外活化的B細(xì)胞的染色體易位，在IL-

11、6(interleukin- 6，白介素-6)轉(zhuǎn)基因的小鼠體內(nèi)導(dǎo)致多克隆的漿細(xì)胞增多癥。</p><p>　　我們將展示在沒(méi)有p53基因的情況下，Pc感染在成熟B細(xì)胞淋巴瘤中的作用效果。瘧疾能改變淋巴瘤的生成從而促成成熟GC或后GC B細(xì)胞淋巴瘤，同時(shí)也能破壞快速增殖的AID表達(dá)的GC B細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性。</p><p>　　Figure 1.B細(xì)胞對(duì)瘧原蟲感染有應(yīng)答</p>

12、;<p>　　(A和B)脾細(xì)胞總數(shù)，B細(xì)胞總數(shù)(A)和生發(fā)中心B細(xì)胞(B)，感染之后數(shù)目變化。帶有標(biāo)準(zhǔn)差的均數(shù)如圖所示，并且每個(gè)點(diǎn)的值來(lái)自于至少5只小鼠的數(shù)據(jù)。</p><p>　　(C)AID的表達(dá)僅限于生發(fā)中心的B細(xì)胞。來(lái)自于瘧原蟲感染的標(biāo)記AID小鼠的脾細(xì)胞利用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。最上邊的折線展示的是一段時(shí)間以內(nèi)有生發(fā)中心(綠)和無(wú)生發(fā)中心(紅)的B細(xì)胞的相對(duì)繁殖數(shù)目(B220+B細(xì)胞)。最下面的

13、折線展現(xiàn)了非B細(xì)胞(B220-，灰色)，非生發(fā)中心B細(xì)胞(B220+CD38+CD95-，紅色)和生發(fā)中心B細(xì)胞(B220+CD38-CD95+，綠色)綠色熒光標(biāo)記的AID表達(dá)情況。每個(gè)點(diǎn)的值來(lái)自于至少3只小鼠的數(shù)據(jù)。</p><p>　　(D)瘧疾感染生發(fā)中心B細(xì)胞的AID蛋白。左邊的設(shè)門策略和右邊的半定量的western分析將接種3周后的細(xì)胞分為了亮區(qū)(LZ)細(xì)胞和暗區(qū)(DZ)細(xì)胞。三角形的區(qū)域顯示的是3倍的

14、系列稀釋。AID-/-(AID敲除的純合)和野生型控制對(duì)照組是來(lái)自于體外激活的B細(xì)胞各自的基因型。兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果之一如圖?？梢?jiàn)Figure S1。</p><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　　瘧原蟲感染引發(fā)生發(fā)中心進(jìn)行AID表達(dá)</p><p>　　我們利用Pc在鼠體內(nèi)產(chǎn)生慢性瘧疾感染，與早先的報(bào)告相同，寄生蟲血癥在感染

15、開(kāi)始7-10天的時(shí)候出現(xiàn)高峰，隨后出現(xiàn)了脾細(xì)胞總量的增多(均值大約是286.6百萬(wàn)細(xì)胞每個(gè)脾，在三周內(nèi)實(shí)現(xiàn)了4倍的增殖)，包括B淋巴細(xì)胞(均值為130.4百萬(wàn)細(xì)胞每個(gè)脾，在四周內(nèi)擴(kuò)增了3倍；詳見(jiàn)Figures 1A and S1A)。引人注目的是，脾的GC B細(xì)胞擴(kuò)增了63倍之多(均值為15.4百萬(wàn)GC B細(xì)胞每個(gè)脾，時(shí)間是三周)，這種狀態(tài)持續(xù)了超過(guò)10周(Figure 1B)。我們得出的結(jié)論是瘧原蟲感染引發(fā)了強(qiáng)大的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的GC B

16、 細(xì)胞擴(kuò)增。</p><p>　　Ig體細(xì)胞突變和類別轉(zhuǎn)換重組是由AID引發(fā)的。這種酶被限制在生發(fā)中心的活化B細(xì)胞內(nèi)，但是瘧疾引發(fā)的感染激活了B細(xì)胞。為了確定在Pc感染當(dāng)中AID是否被抑制，我們檢查了AID純合的基因報(bào)告小鼠，發(fā)現(xiàn)AID表達(dá)受限于GC B細(xì)胞并持續(xù)了至少10周的時(shí)間(Figures 1C and S1B)。為了證實(shí)AID蛋白的表達(dá)，我們選取了暗區(qū)和亮區(qū)的GC B細(xì)胞進(jìn)行了蛋白印跡分析。不出所料，A

17、ID主要在暗區(qū)發(fā)現(xiàn)，這個(gè)數(shù)字比亮區(qū)或者體外活化B細(xì)胞當(dāng)中多3倍(Figure 1D)。因此我們得出結(jié)論AID在瘧原蟲感染的GC B細(xì)胞中為主要表達(dá)。</p><p>　　瘧疾感染的生發(fā)中心存在廣泛的染色體易位現(xiàn)象</p><p>　　AID和復(fù)制相關(guān)的復(fù)制壓力可以獨(dú)自導(dǎo)致培養(yǎng)B細(xì)胞的DNA斷裂和染色體易位。為了定位體內(nèi)瘧原蟲感染造成的DNA破壞，我們采取了之前描述的下一代捕捉和測(cè)序技術(shù)(T

18、C-seq)。帶有c-myc基因I-SceI識(shí)別位點(diǎn)的小鼠被我們培育成ROSAerISCEI(編碼I-SceI以融合雌激素感受器配體結(jié)合域)轉(zhuǎn)基因小鼠和AID缺乏或者AID過(guò)量表達(dá)的小鼠((ROSAAIDer，見(jiàn)實(shí)驗(yàn)流程，F(xiàn)igure S2)。MycI/IROSAerISCEI/erISCEIAID-/- 和MycI/IROSAerISCEI/AIDer小鼠注射了瘧原蟲并且在GC反應(yīng)的高峰期用他莫昔芬處理，以在AID或有或無(wú)兩種情況下，

19、利用TC-seq技術(shù)捕捉處理引起的erISCEI核穿梭、15號(hào)染色體MycI基因的DNA斷裂所致易位和基因組其他位置的損傷。</p><p>　　我們?cè)?.05億個(gè)瘧疾感染的AID缺乏或者充足的GC B細(xì)胞中分別找回了191150個(gè)和65905個(gè)MycI基因I-SceI位點(diǎn)的獨(dú)特重排(見(jiàn)實(shí)驗(yàn)流程)。與先前的體外試驗(yàn)吻合，重排更容易發(fā)生在染色體內(nèi)(所有重排相關(guān)的顯示分別為95.2%和94.3%，F(xiàn)igure 2B)

20、)，并且豐富了I-SceI位點(diǎn)。不管AID有沒(méi)有表達(dá)，重排在基因區(qū)的增長(zhǎng)顯著，超過(guò)了預(yù)期40.1%的任意分布(Figure 2D)，促成了更多活躍的轉(zhuǎn)錄基因(Figure 2E)。與此一致的是，I-SceI位點(diǎn)中轉(zhuǎn)錄方向的不對(duì)稱分布結(jié)果在瘧疾生發(fā)中心中的展現(xiàn)要比體外模擬的B細(xì)胞要少，它表達(dá)了更高水平的c-myc基因(Figures 2C and S2E)。我們得出的結(jié)論是，有瘧原蟲體內(nèi)感染引發(fā)的染色體重排的總體分布和體外逆轉(zhuǎn)錄感染的細(xì)胞

21、相似。</p><p>　　與DNA復(fù)制脆性位點(diǎn)有關(guān)的AID非依賴性的破壞</p><p>　　早期復(fù)制脆弱位點(diǎn)是一段染色體基因序列，在DNA復(fù)制的過(guò)程中易于突變的序列。為了估計(jì)DNA復(fù)制在瘧疾導(dǎo)致的重組中的作用，我們分析了ERFSs中的病毒整合位點(diǎn)的出現(xiàn)情況。ERFSs中的一小部分的易位現(xiàn)象在AID存在或者不存在兩種情況下是相似的(分別是總數(shù)的1.5%和2%)并且極大的豐富了蒙特卡羅統(tǒng)計(jì)

22、模擬方法決定的隨機(jī)分布(Figure 3A)。ERFSs的易位更容易在基因區(qū)發(fā)生，尤其是經(jīng)常進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的基因(Figure S3)。相反，在普通脆性位點(diǎn)中并沒(méi)有被豐富，而普通脆性位點(diǎn)是晚期復(fù)制區(qū)，更容易在有絲分裂時(shí)被破壞(Figure 3B)。我們得出的結(jié)論是在瘧疾引發(fā)的GC B細(xì)胞DNA損傷更容易出現(xiàn)在ERFSs，不論AID存在與否。</p><p>　　AID損傷瘧疾感染GC B細(xì)胞的染色體組</p>

23、;<p>　　為了確定AID具體破壞了GC B細(xì)胞基因組的哪一部分區(qū)域，我們利用嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)了AID缺乏和AID充足的細(xì)胞TC序列文庫(kù)在易位中局部累積的情況，正如之前預(yù)想的，在lgh基因座中我們觀察到了AID依賴的易位的“熱點(diǎn)”，這些累積發(fā)生在Sm, Sγ2b和 Sγ2a等轉(zhuǎn)換區(qū)間內(nèi)(Figure 4A; Table S1)。相反的，B細(xì)胞AID基因的易位激活了體外形成的熱點(diǎn)，尤其是在Sm, Sγ1和 Sγ3等處(Fig

24、ure 4A)。還有其他15個(gè)熱點(diǎn)在無(wú)lg區(qū)間被觀察到，在c-myc基因和靠近Ly6e基因處AID依賴的突變活性脫靶效應(yīng)也被證實(shí)(Figures 4B, 4C, and S4A;Table S1)。這與之前的研究報(bào)告相符，AID基因易位豐富了基因區(qū)間并且促成了更多的高轉(zhuǎn)錄活性的基因(Figures S4B and S4C)。更重要的是，在體內(nèi)沒(méi)有任何類似體外AID易位脫靶效應(yīng)被觀察到(Table S1)?？傊诎╨gh基因座在內(nèi)的A

25、ID依賴的熱點(diǎn)處總共只有總量的0.7%。我們得出的結(jié)論是AID首先破壞GC B細(xì)胞的lg區(qū)間，當(dāng)然也不止會(huì)破壞lg區(qū)間。</p><p>　　AID促成了晚期淋巴瘤</p><p>　　除了c-myc基因的激活，B細(xì)胞淋巴瘤同時(shí)也存在著頻繁的p53基因的突變。為了模擬這種現(xiàn)象，我們準(zhǔn)備了帶有B細(xì)胞特異的p53基因缺陷的小鼠(CD19cre/+p53lox/lox)并且非AID充足即AID缺

26、乏的小鼠。p53基因的敲除并沒(méi)有顯著改變小鼠體內(nèi)B淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)(Figure S5)。為了模仿地方性瘧疾地區(qū)的慢性暴露的情況，我們進(jìn)行了兩組重復(fù)的實(shí)驗(yàn)，分別進(jìn)行Pc感染和疾病的模擬。小鼠在AID依賴的模式下進(jìn)行淋巴瘤發(fā)生(Figure 5)。瘧疾不是淋巴瘤發(fā)生的必要條件，但是它改變了表型來(lái)促進(jìn)更多的成熟的B細(xì)胞淋巴瘤(Figure 6)。</p><p>　　11只野生型的小鼠當(dāng)中沒(méi)有任何一只在感染之后生病，而

27、p53基因缺乏的兩組小鼠全部死亡，CD19cre/+p53lox/lox存活天數(shù)中位數(shù)是60周，CD19cre/+p53lox/loxAID-/-存貨天數(shù)中位數(shù)是58周(Mantel-Cox檢驗(yàn)的p=0.8，F(xiàn)igure 5A)。然而，所有的12只CD19cre/+p53lox/lox小鼠都患上淋巴瘤，同時(shí)15只CD19cre/+p53lox/loxAID-/-小鼠當(dāng)中只有5只有淋巴瘤的患病跡象(占比33%，費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)的p<0

28、.0004，F(xiàn)igures 5B and 5C)。CD19cre/+p53lox/loxAID-/-小鼠中的大部分(67%)都出現(xiàn)了脾腫大的癥狀，并伴有骨髓外造血，但是沒(méi)有患癌的組織跡象(Figures 5B–5D)。與缺少轉(zhuǎn)化能力一致，這些小鼠體內(nèi)的脾細(xì)胞不能在體外進(jìn)行擴(kuò)增(n = 5)，相反的4組對(duì)照組淋巴瘤中3組能夠?qū)崿F(xiàn)體外擴(kuò)增(觀察時(shí)間為3周)。更重要的是，4只免疫缺陷的小鼠當(dāng)中只有1只患上了淋巴瘤，這些小鼠都被移植了來(lái)自于瘧疾

29、感染的小鼠的CD19cre/+p53lox/loxAID-/-脾細(xì)胞(Fi</p><p>　　Figure 2.瘧疾GC B細(xì)胞中的易位</p><p>　　實(shí)驗(yàn)草案的示意圖表：確認(rèn)了體內(nèi)瘧原蟲引發(fā)染色體的重排</p><p>　　I-SceI核酸內(nèi)切酶在15號(hào)染色體上捕獲的重排讀序的染色體分布圖</p><p>　　核酸酶內(nèi)切位點(diǎn)周圍的描

30、述，小圓點(diǎn)組成的折線代表的是AID不足的樣本</p><p><b>　　基因重排的比例</b></p><p>　　不同轉(zhuǎn)錄水平的基因重排發(fā)生的頻率，空白柱代表的是AID不足的樣本，水平線代表的是基于隨機(jī)模型的理想頻率</p><p>　　總之，瘧疾GC B細(xì)胞的基因重排與培養(yǎng)的B細(xì)胞進(jìn)行了對(duì)比，可見(jiàn)Figure S2。</p>

31、<p>　　而為了確定AID在控制瘧疾中是否必要，我們給AID-/-小鼠進(jìn)行了預(yù)防注射并且在一段時(shí)間內(nèi)模擬了寄生蟲血癥。不考慮p53基因的影響，AID不足并沒(méi)有改變急性感染，但是AID在慢性感染階段終止寄生蟲血癥中是需要的(Figures S5F)。與這個(gè)發(fā)現(xiàn)相符，AID不足與貧血癥、脾腫大、骨髓外造血和生存率減少相關(guān)聯(lián)。我們得出了結(jié)論：AID促進(jìn)了瘧原蟲感染的淋巴瘤發(fā)生，控制慢性瘧疾感染也需要AID的參與。</p&g

32、t;<p>　　Figure 3.DNA復(fù)制脆性區(qū)域的非依賴AID的DNA損傷</p><p>　　早期DNA復(fù)制脆性位點(diǎn)處的病毒整合位點(diǎn)的染色體重排的觀察數(shù)目(ERFSs，紅點(diǎn))，并與蒙特卡羅隨機(jī)模擬相對(duì)比(兩者p < 0.001)。</p><p>　　普通脆性位點(diǎn)的染色體重排的數(shù)目(CFSs，紅點(diǎn))，并與蒙特卡羅隨機(jī)模擬相對(duì)比。</p><p&

33、gt;　　可見(jiàn)Figure S3。</p><p>　　Figure 4.AID促進(jìn)了瘧原蟲引發(fā)的DNA損傷</p><p>　　AID靶點(diǎn)lgh的易位。紅色矩形說(shuō)明了AID熱點(diǎn)的位置，這些熱點(diǎn)的4kb區(qū)域在頂部已被標(biāo)出，豎直的線段表示獨(dú)立的易位事件。上邊的數(shù)字則說(shuō)明了每個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域的易位發(fā)生總數(shù)。培養(yǎng)的B細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)的AID也顯示出來(lái)以作對(duì)比。TPKT是文庫(kù)中每1000個(gè)易位每千個(gè)堿基

34、對(duì)發(fā)生易位的正常數(shù)目。</p><p>　　瘧疾引發(fā)的AID依賴的易位中無(wú)lgh熱點(diǎn)的例子。顯示的是一個(gè)1kb區(qū)域，每條豎直線段代表的是一個(gè)獨(dú)立的易位。左邊的數(shù)字是易位的總數(shù)。</p><p>　　利用MutPE-序列技術(shù)得到的瘧疾GC B細(xì)胞的突變分析。對(duì)于c-myc基因，內(nèi)含子1中的兩段相鄰的區(qū)域進(jìn)行了分析。*所有的p< 0.000001(單邊t檢驗(yàn))。</p>&

35、lt;p>　　可見(jiàn)Figure S4和Table S1。</p><p>　　瘧原蟲引發(fā)的淋巴瘤的表型和核型</p><p>　　我們使用了流式細(xì)胞儀來(lái)描述AID充足的CD19cre/+p53lox/lox小鼠淋巴瘤的表型。受到感染的和沒(méi)有受到感染的小鼠患淋巴瘤具有相似的動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)(感染60周的中位數(shù)和無(wú)感染的63周的中位數(shù)，Mantel-Cox檢驗(yàn)p=0.07，F(xiàn)igure S6A

36、)。然而，瘧疾感染的小鼠患的是B細(xì)胞淋巴瘤，很大一部分展現(xiàn)的是GC起源的更加成熟的表型(72.7%，n=11，lg轉(zhuǎn)換或者CD138+轉(zhuǎn)換)，與此同時(shí)，大多數(shù)的未感染的對(duì)照小鼠患上的是前GC淋巴瘤(83.3%，n=12，費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)p< 0.01，F(xiàn)igures 6A和S6B，Tables 1, S2和S3)。作為對(duì)照，我們用羊血紅細(xì)胞反復(fù)對(duì)一組AID充足的CD19cre/+p53lox/lox小鼠進(jìn)行免疫反應(yīng)，羊血紅細(xì)胞是一種

37、具有良好特異性的抗原可以促使長(zhǎng)壽命的GC產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)中生存下來(lái)的小鼠與羊血紅細(xì)胞免疫過(guò)的小鼠具有相似性(中位數(shù)是68周，Mantel-Cox檢驗(yàn)p>0.2，F(xiàn)igure S6A)。但是，對(duì)比瘧疾感染，只有一小部分的羊血紅細(xì)胞引發(fā)的淋巴瘤顯示了后GC的表型(費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)p<0.03，F(xiàn)igure S5C，Tab</p><p>　　瘧疾相關(guān)的Burkitt淋巴瘤存在著特征性的染色體易位現(xiàn)象，包括c-my

38、c基因和lg基因。為了確定瘧原蟲引發(fā)的淋巴瘤是否與易位相關(guān)，我們利用了多彩熒光原位雜交技術(shù)分析了腫瘤中期染色體涂片。我們發(fā)現(xiàn)所有能夠提供信息的淋巴瘤(n=7)包含了克隆的易位，4組(L4、L23、L24和L62)顯示了多重易位，1組(L62)發(fā)生了三條染色體的復(fù)雜易位(Figure 6B，Table 1)。淋巴瘤L23在12號(hào)和15號(hào)染色體的易位T(12；15)，與在姥鮫烷引發(fā)的漿細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)的c-myc/Igh易位相似(Figure

39、6B；Potter和Wiener，1992)。為了在更高的分辨率下檢驗(yàn)淋巴瘤L23，我們測(cè)出了它的染色體組的序列(可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)步驟；Figure S7)。生物信息學(xué)分析證明了c-myc/Igh易位T(12；15)的存在，同時(shí)也有預(yù)料之中的的p53基因座的敲除和lgh和lgk基因座的生理性重排(Figure 6C；數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。序列分析也識(shí)別出了T(18；3)的斷裂點(diǎn)和揭示了其他的染色體內(nèi)、染色體間的重排，而這些并沒(méi)有在多彩熒光原位雜交技術(shù)

40、分析被檢測(cè)出來(lái)(Figures 6C，S7B和S</p><p>　　Figure 5.p53基因抑制、AID促進(jìn)瘧原蟲引發(fā)的淋巴瘤</p><p>　　瘧原蟲感染的存活小鼠。所有的小鼠為CD19cre/+。</p><p>　　瘧原蟲感染的CD19cre/+p53lox/lox小鼠的脾組織學(xué)切片。L4是AID充足的淋巴瘤，S2是AID缺乏的良性B細(xì)胞增生，特點(diǎn)是骨

41、髓外造血。</p><p>　　瘧原蟲感染的小鼠淋巴瘤和良性增生的對(duì)比。淋巴組織經(jīng)過(guò)了組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞儀的檢查。良性增生是指小鼠脾腫大、具有局限在濾泡區(qū)正常B細(xì)胞和B220+細(xì)胞。非典型的增生或者早期瘤形成造成了脾腫大和B220+細(xì)胞侵入動(dòng)脈周圍淋巴鞘(PALS)。淋巴瘤定義了異常的淋巴組織結(jié)構(gòu)和、或侵染到多器官中。</p><p>　　瘧原蟲感染的小鼠的骨髓外造血現(xiàn)象。脾部

42、分的骨髓外造血程度也進(jìn)行了檢測(cè)。</p><p>　　可見(jiàn)Figure S5和Table S2。</p><p><b>　　討論</b></p><p>　　Burkitt淋巴瘤是一種成熟B細(xì)胞淋巴瘤，雖然是偶發(fā)性疾病，但是在免疫缺陷個(gè)體和近赤道的地方性瘧疾高發(fā)區(qū)中有著更高的發(fā)生率。除了瘧疾感染，大多數(shù)個(gè)體患eBL的原因也有EBV的感染，這是

43、一種編碼癌原蛋白的病毒，它能夠引發(fā)淋巴瘤生成。因此，EBV被認(rèn)為是在轉(zhuǎn)變過(guò)程扮演了直接的角色。但是，瘧疾對(duì)于淋巴瘤的作用仍是不易闡述的。我們發(fā)現(xiàn)瘧原蟲不改變?cè)跀y帶有純合敲除的p53基因的B細(xì)胞中癌癥的發(fā)生率。因此，瘧原蟲感染并不能單獨(dú)引發(fā)癌癥，因此還需要EBV感染和其他的轉(zhuǎn)變事件等。反倒是寄生蟲感染能夠改變淋巴瘤的表型，通過(guò)引發(fā)包含AID表達(dá)B細(xì)胞的慢性形成的GC來(lái)促進(jìn)形成更成熟B細(xì)胞淋巴瘤。</p><p>　

44、　包括eBL在內(nèi)的成熟B細(xì)胞淋巴瘤經(jīng)常與帶有標(biāo)記的癌原性的易位相關(guān)聯(lián)，同時(shí)GC B細(xì)胞中顯示出表型和分子的特征。然而，仍然不確定的是在生發(fā)中心和早期發(fā)展階段時(shí)易位是否已經(jīng)發(fā)生。為了支持生發(fā)中心是淋巴瘤發(fā)生的環(huán)境這一概念，我們記錄了在瘧疾GC中普遍發(fā)生的染色體易位現(xiàn)象。這與這些快速增殖細(xì)胞中具有高表達(dá)AID和DNA復(fù)制相一致。早期DNA復(fù)制位點(diǎn)中的早期復(fù)制脆性位點(diǎn)和十分脆弱以至于其復(fù)制叉容易瓦解。ERFS DNA在GC中豐富，并且大多數(shù)為

45、常染色質(zhì)。易位現(xiàn)象在ERFS中顯著豐富，但是在普通脆性位點(diǎn)(CFSs)中并不常見(jiàn)。由于之前的結(jié)論是CFSs存在于淋巴瘤基因重排中，這一發(fā)現(xiàn)并不在預(yù)料當(dāng)中。</p><p>　　AID在瘧疾相關(guān)的淋巴瘤生成中并不是絕對(duì)需要的，因?yàn)橐恍〔糠值膒53基因缺陷的AID-/-小鼠也患上了淋巴瘤。此外，只有一部分在體內(nèi)的瘧疾GC B細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的重排可以認(rèn)為是AID影響的。盡管如此，AID很有可能強(qiáng)烈的促進(jìn)淋巴瘤生成，因?yàn)槌?/p>

46、了導(dǎo)致染色體易位之外，它還能直接是癌基因突變。</p><p>　　在瘧原蟲超級(jí)感染不存在的情況下，EBV與B細(xì)胞瘤有聯(lián)系而不是eBL。比如，EBV在漿細(xì)胞瘤和Hodgkin淋巴瘤中經(jīng)常性的被檢測(cè)到，大約三分之一的免疫缺陷相關(guān)的彌散性大規(guī)模的B細(xì)胞淋巴瘤是EBV陽(yáng)性的。再者，當(dāng)免疫監(jiān)視功能受損的時(shí)候，EBV基因LMP1就會(huì)獨(dú)自直接促進(jìn)B細(xì)胞轉(zhuǎn)化。因此，EBV在B細(xì)胞中是癌原性的，但是它獨(dú)自不能產(chǎn)生特定表型的eBL

47、。相似的，p53基因的突變和其他癌基因并不是eBL獨(dú)有的，因?yàn)樗鼈冊(cè)贐細(xì)胞的惡性病變中普遍存在。具有獨(dú)特表型的eBL反而更特征性的與瘧疾相關(guān)。最重要的是所有的eBL都攜帶有l(wèi)g區(qū)域的c-myc基因易位，而且AID可以使兩個(gè)位點(diǎn)都發(fā)生DNA的損傷，從而導(dǎo)致它們的易位。通過(guò)在GC中引發(fā)長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)的、高水平的AID，瘧疾扮演了疾病修飾者的角色使得B細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中易于獲得c-myc基因的易位，這就反映了eBL的分子和表型特征。</p&g

48、t;<p>　　Figure 6.瘧原蟲引發(fā)的淋巴瘤中的染色體組重排</p><p>　　(A)瘧原蟲感染中的淋巴瘤表型分布和對(duì)照組沒(méi)有感染的CD19cre/+p53lox/lox小鼠。</p><p>　　(B)瘧原蟲引發(fā)的CD19cre/+p53lox/lox淋巴瘤典型的M-FISH中期圖像。箭頭指向可檢測(cè)到易位的染色體</p><p>　　(C)

49、L23基因組的基因組序列的Perl語(yǔ)言編寫可視化圖表(CIRCOS)。紅色弓形線代表的是染色體間的重排，綠色的弓形線則是代表染色體內(nèi)的重排。對(duì)于基因重排，基因的名字已被顯示出來(lái)。加星號(hào)的是說(shuō)明如果重組位點(diǎn)是一個(gè)已知的AID靶點(diǎn)(紅色星號(hào))或者病毒在ERFSs上的整合熱點(diǎn)(綠色星號(hào))。</p><p>　　可見(jiàn)Figures S6和S7和Tables S3，S4和S5)。</p><p>&

50、lt;b>　　實(shí)驗(yàn)流程</b></p><p><b>　　小鼠和寄生蟲</b></p><p>　　所有的實(shí)驗(yàn)都是按照實(shí)驗(yàn)草案進(jìn)行的，這一草案是通過(guò)洛克菲勒大學(xué)動(dòng)物關(guān)懷和利用委員會(huì)授權(quán)的。研究中使用的小鼠包括帶有CD19cre/cre、p53lox/lox、AID-/-、AIDGFP、IgHI-96k/+、MycI/I和IgHI/I以及IgkAID

51、基因的小鼠。ROSAAIDer和ROSAerISCEI這兩種對(duì)立基因位點(diǎn)是人工通過(guò)基因靶向技術(shù)將ROSA基因座轉(zhuǎn)到C2J胚胎干細(xì)胞當(dāng)中，正如之前描述的，loxP兩側(cè)的轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)已經(jīng)通過(guò)與EIIAcre小鼠雜交的方式從胚胎時(shí)期就已敲除。除了免疫缺陷的NRG基因系列，研究中的小鼠不是C57Bl/6小鼠的后代就是雜交11代以上的。夏氏瘧原蟲是從全國(guó)衛(wèi)生研究所(NIH)國(guó)立變態(tài)反應(yīng)與傳染病研究所(NIAID)的BEI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的。</p

52、><p><b>　　瘧原蟲感染</b></p><p>　　寄生蟲是冰凍保存的，并且是用野生型小鼠進(jìn)行培養(yǎng)的。為了分析B細(xì)胞的反應(yīng)，供體小鼠105個(gè)Pc感染的血紅細(xì)胞以腹膜內(nèi)注射的方式感染6到12周大的小鼠。在腫瘤實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，6到8周的小鼠是進(jìn)行初次感染所用，而再次感染和三次感染是用的8周大的小鼠，并且劑量和用法是相同的。在室溫下注射了1μl的帶有抗Ter119 (來(lái)自于

53、eBiosciences)和Hoechst33342(來(lái)自于Invitrogen)血液30分鐘后，利用流式細(xì)胞儀監(jiān)控寄生蟲血癥，并且用血涂片分析。</p><p>　　羊血紅細(xì)胞的免疫反應(yīng)</p><p>　　用4ml的PBS稀釋1ml的羊血紅細(xì)胞(來(lái)自于Colorado Serum Company)，腹膜內(nèi)注射0.2ml的混合物。小鼠在4周內(nèi)進(jìn)行5次免疫注射。</p>&l

54、t;p><b>　　流式細(xì)胞儀技術(shù)</b></p><p>　　用熒光標(biāo)記抗體BD(來(lái)自于PharMingen或eBiosciences)的抗性小鼠的淋巴或者癌組織的單細(xì)胞懸液是為了檢測(cè)CD19，B220，GL-7，F(xiàn)AS，CD43，CD3或生物素標(biāo)記的CXCR4抗體，隨后是APC標(biāo)記的鏈霉親和素。樣本是通過(guò)FACSCalibur或Fortessa設(shè)備(來(lái)自于Becton Dickin

55、son)獲得的，用FlowJo軟件進(jìn)行的分析。</p><p><b>　　免疫印跡試驗(yàn)</b></p><p>　　生發(fā)中心的明區(qū)和暗區(qū)B細(xì)胞是從接種Pc3周后的小鼠的脾臟內(nèi)純化取出的。利用微珠進(jìn)行磁性富集，B細(xì)胞當(dāng)中加入了抗體以選擇DZ (B220+CD38-GL7+FAS+CXCR4hiCD86lo)和LZ(B220+CD38-GL7+FAS+CXCR4loCD

56、86hi) B細(xì)胞，這種選擇是靠Diva選擇或FACSAria器材、實(shí)現(xiàn)的(來(lái)自于Becton Dickinson，>95%的純度)。將野生型小鼠的靜息淋巴細(xì)胞和AID-/-小鼠用免疫磁性的方式、抗CD43微球(來(lái)自于Miltenyi Biotech)去除脾臟并在25μg/ml的LPS、5ng/ml的IL-4的條件下進(jìn)行4天的培養(yǎng)。這樣AID就能夠被檢測(cè)出來(lái)。</p><p>　　瘧疾GC B細(xì)胞的純化和T

57、C-Seq文庫(kù)的準(zhǔn)備</p><p>　　在進(jìn)行瘧原蟲感染的3-5周之后，MycI/IROSAerISCEI/AIDer或MycI/IROSAerISCEI/erISCEIAID-/-小鼠腹膜注射0.8mg的溶解在玉米油中的他莫昔芬，36小時(shí)之后進(jìn)行安樂(lè)死。紅細(xì)胞裂解之后，脾單細(xì)胞懸液在生物素標(biāo)記的小鼠CD43、CD11c、F4/80、Gr-1和lgD中冰下孵育20分鐘(所有材料來(lái)自于BD PharMingen或

58、eBiosciences)。在洗滌的時(shí)候，細(xì)胞與抗生物素的微球孵育，同時(shí)在磁性縱列中呈負(fù)減少。隨后進(jìn)行抗CD19的微球陽(yáng)性磁性選擇。GC B細(xì)胞的純度由流式細(xì)胞計(jì)數(shù)監(jiān)控，范圍在88%-95%。兩個(gè)TC-seq文庫(kù)的每個(gè)基因型都是獨(dú)立的培養(yǎng)，c-myc基因I-SceI位點(diǎn)的捕獲、利用更新的連接體排除(5’-GCA GCG GAT AAC AATTTC ACA CAG GAC GTA CTG TGC GGC CGC T和5’-/5Phos/

59、GCG GCCGCA CAG TAC TTG ACT GAG CTT TA/3 ddC/)。高通量基因組測(cè)序在已提到的HiSeq中使用，100個(gè)周期，雙向進(jìn)行。</p><p>　　多彩熒光原位雜交技術(shù)</p><p>　　為了分析染色體重排，原始腫瘤細(xì)胞的中期涂片在100 ng/ml的秋水仙胺中處理1小時(shí)，用21×小鼠進(jìn)行雞尾酒探針?biāo)幬锓ǖ碾s交。圖像由帶有自動(dòng)掃描功能的Zeis

60、s AxioImagerM1進(jìn)行采集和展示。</p><p><b>　　基因編號(hào)</b></p><p>　　本文的TC-seq和淋巴瘤L23序列數(shù)據(jù)的科學(xué)研究文摘的編號(hào)是SRP053308。</p><p><b>　　增補(bǔ)信息</b></p><p>　　包括Supplemental Expe