結(jié)腸直腸癌染色體不穩(wěn)定的發(fā)生途徑及其機制研究.pdf

1、絕大多數(shù)腫瘤特別是實體瘤細(xì)胞常表現(xiàn)為染色體不穩(wěn)定性（通常體現(xiàn)為整條染色體的獲得或缺失，即染色體非整倍體等）；非整倍體，指的是細(xì)胞中染色體數(shù)目發(fā)生了改變；染色體不穩(wěn)定性，指的是染色體獲得或丟失的頻率，是一種速率（細(xì)胞內(nèi)染色體以很高的速率發(fā)生變化），兩者都被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要推動力：腫瘤中非整倍體細(xì)胞的比例與腫瘤的惡化進程、轉(zhuǎn)移風(fēng)險、治療效果以及復(fù)發(fā)率等密切相關(guān)。
　　 事實上，在癌癥以及癌細(xì)胞體外培養(yǎng)的發(fā)生發(fā)展中，非整倍體細(xì)

2、胞和染色體不穩(wěn)定與之有著何種關(guān)系，到目前為止其內(nèi)在的機理仍不清楚。提出了許多假說，其中有的甚至是相互對立的假說，都試圖解開兩者之間的關(guān)系。比如，落后染色體和染色體橋都會在細(xì)胞分裂過程中造成遺傳物質(zhì)發(fā)生丟失，從而造成染色體不穩(wěn)定和非整倍體細(xì)胞的出現(xiàn)；確保染色體正確復(fù)制和分離過程的基因（其中包括：細(xì)胞周期檢測點、紡錘體檢測點、姊妹染色單體粘合、著絲粒／動粒的結(jié)構(gòu)和功能、中心體與微管形成等等基因）在細(xì)胞傳代過程中累積損傷發(fā)生改變也會導(dǎo)致染色體

3、的不正確分配，從而造成染色體不穩(wěn)定和非整倍體細(xì)胞的增多。這些機理都試圖闡明其是染色體不穩(wěn)定和非整倍體真正機理。但上述細(xì)胞分裂錯誤是否能真正產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞以及非整倍體細(xì)胞假設(shè)真的產(chǎn)生后其命運如何？染色體不穩(wěn)定的發(fā)生途徑到底有哪些以及各種途徑產(chǎn)生的頻率如何？這些問題則仍需實驗來闡明。
　　 在本研究中，我們選取3種結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系，其中，HT29、SW480染色體不穩(wěn)定(CIN)，HCT116染色體穩(wěn)定(Non-CIN);用月旨質(zhì)

4、體轉(zhuǎn)染法把綠色熒光蛋白H2B-GFP轉(zhuǎn)入細(xì)胞；有限稀釋法在三種細(xì)胞系中建立了單克隆，隨機選取9個單克?。糠N細(xì)胞系3個）連續(xù)傳代到60代，每隔10代對每個單克隆的細(xì)胞用著絲粒特異的探針進行熒光原位雜交，分析其染色體組成。由于是每隔一定代數(shù)來分析染色體組成，相當(dāng)于對細(xì)胞動態(tài)生長過程的連續(xù)追蹤。這樣很容易知道染色體不穩(wěn)定發(fā)生在哪個階段，各個階段發(fā)生的頻率分別是多少。同時用胞質(zhì)阻斷微核實驗法(CBMN)結(jié)合FISH來分析選擇細(xì)胞克隆和代數(shù)的染

5、色體丟失和染色體不分離。我們還選擇了染色體不穩(wěn)定發(fā)生最劇烈的克隆和代數(shù)進行長時間活細(xì)胞攝影結(jié)合熒光原位雜交進行分析，由于利用長時程活細(xì)胞實時攝影能觀察細(xì)胞的實時分裂過程，同時結(jié)合熒光原位雜交(FISH)來檢測活細(xì)胞攝影結(jié)束后各個子細(xì)胞的染色體組成，從而能極其精確的確定各非整倍體細(xì)胞的來源。我們和利用長時間活細(xì)胞實時攝影、熒光原位雜交(FISH)和免疫熒光染色等技術(shù)，探時結(jié)腸直腸染色體不穩(wěn)定的發(fā)生途徑，以期闡明染色體不穩(wěn)定的細(xì)胞和分子生物

6、學(xué)機制。主要實驗結(jié)果如下：
　　 染色體不穩(wěn)定細(xì)胞和染色體穩(wěn)定細(xì)胞的區(qū)別包括：1）、在染色體不穩(wěn)定(CIN)的細(xì)胞系SW480和HT29中，染色體橋的比例明顯高于微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MIN)的細(xì)胞系HCT116;2）、落后染色體，主要指在染色體分離過程中后、末期的落后染色體，不包括染色體向赤道板聚集過程中的前中期和中期落后染色體，同樣是染色體不穩(wěn)定細(xì)胞系明顯高于染色體穩(wěn)定細(xì)胞系；3）、染色體不分離，在染色體穩(wěn)定以及不穩(wěn)定的細(xì)胞系中均有

7、一定的比例，且比例都較低，它們之間沒有明顯的差異；4）、微核在一種染色體不穩(wěn)定的細(xì)胞系(SW480)中十分普遍，但另一種染色體不穩(wěn)定的細(xì)胞系(HT29)以及染色體穩(wěn)定的細(xì)胞系(HCT116)中比例非常低；5）、在染色體不穩(wěn)定的細(xì)胞系中多極分裂的比例明顯比染色體穩(wěn)定的細(xì)胞中高，多極分裂將會大大增加細(xì)胞中的染色體隨機不均等分配，導(dǎo)致大量的子細(xì)胞由于得不到足夠的遺傳物質(zhì)而死亡，極大的增加了染色體不穩(wěn)定的幾率；但有趣的是，有極少數(shù)多極分裂的子細(xì)

8、胞由于選擇性而被保留了下來，具備形成克隆的能力；相比較它的母細(xì)胞而言，在群體生長中可能還具備優(yōu)勢；6）、細(xì)胞周期不同，在染色體不穩(wěn)定的單克隆細(xì)胞中，同一克隆內(nèi)不同核型的細(xì)胞在群體生長過程中，極少數(shù)由多極分裂產(chǎn)生的新的核型子細(xì)胞的增殖速度明顯比母細(xì)胞快。
　　 染色體不穩(wěn)定細(xì)胞和染色體穩(wěn)定細(xì)胞間有如此眾多的不同，染色體不穩(wěn)定的發(fā)生有無主要的途徑？如果有的話是什么途徑？通過對結(jié)腸直腸癌細(xì)胞單克隆的細(xì)胞分裂過程和子細(xì)胞核型深入細(xì)致的研

9、究，我們發(fā)現(xiàn)，在染色體穩(wěn)定和不穩(wěn)定的細(xì)胞系中，大于83％的新產(chǎn)生的非整倍體細(xì)胞是從單克隆建立后細(xì)胞分裂時多極分裂造成的，雙極分裂染色體不分離的比例在染色體穩(wěn)定細(xì)胞和不穩(wěn)定細(xì)胞中的比例分別為8.4%和16.7%。在染色體不穩(wěn)定的細(xì)胞中，落后染色體和染色體橋的比率是染色體穩(wěn)定細(xì)胞系的2-5倍，但是通過FISH檢測細(xì)胞染色體的組成情況后我們發(fā)現(xiàn)，含有落后染色體和染色體橋的細(xì)胞其子細(xì)胞染色體出現(xiàn)有別子母細(xì)胞的比率極低（在我們統(tǒng)計的所有細(xì)胞中只有

10、一個）；而且，統(tǒng)計子細(xì)胞中的微核——一個染色體丟失的指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)其在染色體穩(wěn)定和不穩(wěn)定的細(xì)胞中比率沒有顯著差異。多極分裂的母細(xì)胞即可以是單核細(xì)胞也可以是雙核細(xì)胞，其分裂后產(chǎn)生的子細(xì)胞的核型是多種多樣的，大多數(shù)子細(xì)胞在隨后的生長過程中或凋亡或停滯，只有極少數(shù)特定核型（和母細(xì)胞核型一致或者少一條特定染色體）的細(xì)胞可以形成克隆。多極分裂的子細(xì)胞能夠存活下來，同時能夠克隆化生長同樣在我們的克隆形成實驗中得到證實。藥物處理實驗同樣說明了通過多極分裂

11、產(chǎn)生的特定核型的子細(xì)胞在克隆形成過程中能引起核型發(fā)生巨大變化，且由多極分裂產(chǎn)生的新的核型子細(xì)胞的增殖速度明顯比母細(xì)胞快，這樣在群體生長環(huán)境下，會導(dǎo)致新產(chǎn)生核型的子細(xì)胞在一段相當(dāng)?shù)臅r間內(nèi)逐漸增多而母細(xì)胞核型的細(xì)胞比例逐漸下降。
　　 我們的研究發(fā)現(xiàn)了染色體不穩(wěn)定對于不同的克隆，其演變的趨勢不盡相同，在不同的階段，演化的速率也是變化的；我們還系統(tǒng)的比較了結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系染色體不穩(wěn)定產(chǎn)生的各種途徑，闡明了結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中染色體不穩(wěn)定的