CDK2-AP1改變與微衛(wèi)星不穩(wěn)定結(jié)直腸癌發(fā)生關(guān)系的研究.pdf

1、我國(guó)是世界上新發(fā)癌癥患者最多的國(guó)家,惡性腫瘤是主要死因之一,估計(jì)每年約有130萬人死于惡性腫瘤。而結(jié)直腸癌居腫瘤發(fā)病和癌癥死因第三、四位,而且呈現(xiàn)發(fā)病率不斷攀升和發(fā)病低齡化的特點(diǎn)。近二十年來,隨著我國(guó)居民生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變,結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。因此對(duì)結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)發(fā)病機(jī)制以及防治策略進(jìn)行研究有十分重要的意義。微衛(wèi)星序列是廣泛存在于原核及真核生物基因組中具有高度多態(tài)性的短的

2、串聯(lián)重復(fù)核苷酸序列,由1～6個(gè)核苷酸組成,重復(fù)次數(shù)可達(dá)10～50次。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI)是指DNA復(fù)制時(shí),由于復(fù)制錯(cuò)誤且不能被錯(cuò)配修復(fù)酶更正而引起的簡(jiǎn)單重復(fù)序列的改變。就腫瘤而言,指的是與正常組織相比,在腫瘤中某一微衛(wèi)星由于重復(fù)單位的插入或缺失而造成的微衛(wèi)星長(zhǎng)度的任何改變,出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因現(xiàn)象。MSI現(xiàn)象最早在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn),目前為止,CRC也是MSI研究最多的一種疾病。細(xì)

3、胞周期素依賴激酶2-相關(guān)蛋白1(cyclin-dependent kinase2-associatedprotein1,CDK2-AP1)是個(gè)定位于12q24的高度保守的基因,通過抑制細(xì)胞周期素依賴激酶2的活性發(fā)揮其生長(zhǎng)抑制因子的作用。CDK2-AP1以雜合性丟失和其翻譯產(chǎn)物表達(dá)減少為特點(diǎn),在正常組織中持續(xù)表達(dá)并且與多種細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因素相關(guān)。該基因的表達(dá)缺失見諸多種人類腫瘤,并且與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良相關(guān)。Yuan等通過cDNA芯

4、片發(fā)現(xiàn),高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定(high-frequency MSI,MSI-H)結(jié)腸癌細(xì)胞系CDK2-AP1表達(dá)較微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stable,MSS)細(xì)胞系下降,并且出現(xiàn)增殖活性增高、凋亡減少等生物學(xué)行為改變。MSI-H結(jié)腸癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染CDK2-AP1后,上述表型可以得到逆轉(zhuǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CDK2-AP1基因3’-UTR區(qū)一個(gè)新的微衛(wèi)星位點(diǎn)(T)8改變見于21％(3／14)MSI-H結(jié)腸癌細(xì)胞系及13％(4／

5、31)的MSI結(jié)直腸癌腫瘤組織中,與CDK2-AP1基因表達(dá)下調(diào)相關(guān)。CDK2-AP1基因(T)8位點(diǎn)很可能是一個(gè)MSI-H結(jié)直腸腫瘤相關(guān)的新的重要單核苷酸微衛(wèi)星位點(diǎn)。
　　 本研究通過檢測(cè)CDK2-AP1基因微衛(wèi)星(T)8位點(diǎn)突變?cè)谥袊?guó)浙江漢族人群結(jié)直腸癌患者中的分布情況,明確該位點(diǎn)的改變對(duì)CDK2-AP1基因表達(dá)的影響。通過研究,我們旨在建立惡性腫瘤MSI及基因突變檢測(cè)平臺(tái),為構(gòu)建中國(guó)人特異性基因突變譜、研發(fā)中國(guó)漢族人特異性

6、基因治療策略及預(yù)后評(píng)估等奠定基因組基礎(chǔ)。在實(shí)驗(yàn)過程中,我們首先對(duì)傳統(tǒng)的DNA酚-氯仿抽提法進(jìn)行了改進(jìn),成功從福爾馬林固定后的結(jié)直腸癌患者的腫瘤和正常組織中分別抽提得到能夠滿足繼續(xù)實(shí)驗(yàn)要求的DNA樣本,建立實(shí)驗(yàn)室結(jié)直腸癌患者組織庫。在下一步的MSI-H結(jié)直腸癌患者的篩選過程中,我們引入具有高通量及高敏感性的多重?zé)晒釶CR-毛細(xì)管電泳法(flurescent multiplex polymerase chain reaction-capil

7、lary electrophoresis,FM—CE)檢測(cè)國(guó)際癌癥會(huì)議推薦的BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250共5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在總共506例結(jié)直腸癌腫瘤組織中的微衛(wèi)星狀態(tài),獲取MSI-H結(jié)直腸癌(有2個(gè)或2個(gè)以上位點(diǎn)存在微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象)樣本共73例,約占總檢測(cè)樣本的14.43％,與文獻(xiàn)報(bào)道的頻率相符。同時(shí)我們通過熒光定量PCR的方法檢測(cè)了CDK2-AP1在結(jié)直腸癌細(xì)胞系RKO(MSI-H)和SW480(

8、MSS)中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)該基因在RKO細(xì)胞系中的表達(dá)較SW480細(xì)胞系顯著下調(diào)(P<0.05)。此外,我們還通過熒光定量PCR的方法檢測(cè)了CDK2-AP1在7例MSI-H結(jié)直腸癌患者和10例MSI-L／MSS結(jié)直腸癌患者組織中的表達(dá)情況,但并未發(fā)現(xiàn)兩者間的表達(dá)存在顯著的差異。
　　 本研究根據(jù)CDK2-AP1基因微衛(wèi)星(T)8位點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)單標(biāo)的熒光引物,同樣采用熒光PCR-毛細(xì)管電泳法檢測(cè)73例MSI-H結(jié)直腸癌組織及60例

9、MSS／MSI-L(low—frequency MSI,MSI-L)結(jié)直腸癌組織中(T)8位點(diǎn)的突變情況,但是在檢測(cè)的133例組織中并未發(fā)現(xiàn)(T)8位點(diǎn)缺T突變的存在。而對(duì)其中20例組織的重復(fù)測(cè)序驗(yàn)證也發(fā)現(xiàn)與熒光PCR-毛細(xì)管電泳法相同的結(jié)果。我們通過測(cè)序的方法檢測(cè)了包括RKO(MSI)、CW2(MSI)、Lovo(MSI)、SW480(MSS)、SW620(MSS)、HT29(MSS)和CaCo2(MSS)細(xì)胞系在內(nèi)7個(gè)CRC細(xì)胞系中

10、CDK2-AP1基因(T)8位點(diǎn)的改變情況。結(jié)果意外地在MSI CRC細(xì)胞系CW2中同時(shí)發(fā)現(xiàn)(T)7、(T)8和(T)9的存在,而在其他細(xì)胞系中并沒有發(fā)現(xiàn)(T)7的存在。另外,我們采用SPSS軟件分析了所有檢測(cè)樣本中已收集完全病理資料的170例樣本的微衛(wèi)星狀態(tài)與病人的年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及分化級(jí)別這些臨床病理資料間的關(guān)系.結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSI-H病例與MSS／MSI-L病例相比,兩組患者間在年齡、性別

11、、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及分化級(jí)別之間并沒有顯示存在顯著差異；而相對(duì)MSS／MSI-L病例,MSI-H腫瘤好發(fā)于結(jié)腸(P=0.004<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在腫瘤的分期上,相對(duì)MSS／MSI-L病例,MSI-H腫瘤發(fā)現(xiàn)較早(P=0.047<0.5),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過上述研究,我們得出了以上結(jié)論：FM-CE法具有快速有效敏感性高的特點(diǎn),適合于大樣本人群的微衛(wèi)星狀態(tài)篩選。在中國(guó)浙江漢族人群結(jié)直腸癌患者中并未發(fā)現(xiàn)在