J亞群禽白血病病毒感染DF-1細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)是一類(lèi)通過(guò)水平傳播或垂直傳播，造成禽產(chǎn)生多種良性或惡性的腫瘤的反轉(zhuǎn)錄病毒，其感染產(chǎn)生的腫瘤主要有淋巴細(xì)胞性白血病、成髓細(xì)胞性白血病、骨髓細(xì)胞瘤、血管瘤、禽肉瘤、內(nèi)皮瘤、纖維肉瘤以及真性紅細(xì)胞增多癥等。根據(jù)病毒囊膜糖蛋白抗原差異、病毒干擾實(shí)驗(yàn)以及宿主范圍，從雞體中分離的ALV可以分為6個(gè)亞群(A-E，J)。ALV-J是在1989年被分離鑒定出的禽白血病病毒亞群，主要引起肉用型

2、雞發(fā)生髓細(xì)胞瘤。近年來(lái)盡管禽白血病在世界大部分國(guó)家都得到了有效的控制，然而該病在中國(guó)卻越來(lái)越嚴(yán)重，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。目前由ALV-J引起的禽白血病在中國(guó)呈地方性流行，該病毒造成蛋雞產(chǎn)蛋迅速下降，并能導(dǎo)致蛋雞和一些地方品種雞形成血管瘤。為了探究ALV-J的致病機(jī)理以及病毒與宿主的相互作用，我們運(yùn)用二維電泳結(jié)合質(zhì)譜分析的差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)DF-1細(xì)胞感染ALV-J前后的蛋白表達(dá)變化進(jìn)行研究，以尋找致病和致腫瘤相關(guān)的差異表達(dá)蛋白。<

3、br>　　 1.DF-1細(xì)胞二維電泳方法的建立
　　 二維電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)之一，為了研究DF-1細(xì)胞在感染病毒后的蛋白質(zhì)組學(xué)變化，首先需要建立和優(yōu)化DF-1細(xì)胞二維電泳方法。在本實(shí)驗(yàn)中我們使用17cm固相pH梯度膠條進(jìn)行等電聚焦，對(duì)5種細(xì)胞裂解液的配方進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)還對(duì)蛋白在不同的等電聚焦條件、不同的水化條件、不同的蛋白上樣量、不同SDS-PAGE凝膠濃度條件下的二維電泳圖譜進(jìn)行比較，并用PDQuest軟件分析

4、優(yōu)化選擇。最終確定裂解液成分為7M尿素，2M硫脲，4％(w/v)CHAPS，40mMDTT，0.2％Bio-Lyte3-10,1mM Protease Inhibitor Cocktail;蛋白上樣量為300μg，以主動(dòng)水化的方式溶脹進(jìn)入膠條;等電聚焦過(guò)程采用4，5000VH，二向凝膠濃度確定為12％。從而成功建立了DF-1細(xì)胞的二維電泳方法，獲得分辨率和重復(fù)性均可滿(mǎn)足分析要求的DF-1細(xì)胞的二維電泳圖譜，為后期研究病毒感染細(xì)胞的差異蛋

5、白質(zhì)組學(xué)提供技術(shù)支持。
　　 2.J亞群禽白血病病毒感染DF-1細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 運(yùn)用二維電泳結(jié)合質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)DF-1細(xì)胞在感染ALV-J后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞總蛋白的差異變化情況進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染后6h、12h、1d、2d、3d、5d和7d的7個(gè)階段共有86個(gè)差異蛋白，差異表達(dá)蛋白主要集中在感染后6-12h。質(zhì)譜分析共成功鑒定出74個(gè)差異蛋白，其中30個(gè)上調(diào)，44個(gè)下調(diào)。這些差異表達(dá)蛋白從分子生

6、物學(xué)過(guò)程來(lái)分析主要參與新陳代謝過(guò)程、大分子代謝過(guò)程、生物學(xué)調(diào)控過(guò)程、應(yīng)激反應(yīng)、生物合成等過(guò)程;按蛋白功能來(lái)分主要具有水解酶活性以及蛋白結(jié)合、氧化還原、核酸結(jié)合等功能。通過(guò)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，我們發(fā)現(xiàn)DJ-1、UCHL1、PEBP1、NPM1、HMGB1、ANP32A、TRAP1和VDAC1等蛋白與細(xì)胞凋亡及腫瘤的形成、發(fā)展聯(lián)系緊密。其中DJ-1最初是作為腫瘤基因被發(fā)現(xiàn)的。它在細(xì)胞的轉(zhuǎn)變、蛋白-RNA相互作用的控制、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及男性生

7、育等過(guò)程中起重要作用;UCHL1是去泛素化酶家族重要成員之一，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)多種生物學(xué)過(guò)程中起重要作用;PEBP1是一種磷脂結(jié)合蛋白，又稱(chēng)Raf激酶抑制蛋白。激活的Raf蛋白與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期停滯甚至與凋亡有關(guān);NPM1是核仁磷酸蛋白穿梭于細(xì)胞核與細(xì)胞漿之間，參與核糖體的裝配和轉(zhuǎn)運(yùn)。NPM能對(duì)DNA的損傷進(jìn)行調(diào)控，可以激活NF-κB轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，阻止細(xì)胞發(fā)生凋亡;HMGB1是典型的非組蛋白，屬于HMG高遷移率族蛋白。

8、HMGB1釋放于細(xì)胞外可參與炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化、遷移及神經(jīng)生長(zhǎng)等過(guò)程，并與晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）結(jié)合，參與腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。這些信息為進(jìn)一步研究ALV-J的致病、致腫瘤機(jī)理提供了有用的蛋白質(zhì)相關(guān)基礎(chǔ)依據(jù)。
　　 3.DJ-1、UCHL1、VDAC1、TRAP1和HMGB1基因real-timePCR標(biāo)準(zhǔn)品的制備及各基因在ALV-J感染中變化情況
　　 為了檢測(cè)DJ-1、UCHL1、VDAC1、

9、TRAP1和HMGB1基因在ALV-J感染過(guò)程中的變化，我們利用PCR的方法擴(kuò)增出各基因片段，然后連接pGEM-T載體，構(gòu)建各基因的載體質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。將鑒定正確的各基因的T載體質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)胷eal-time PCR擴(kuò)增各基因分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。然后以ALV-J感染后的DF-1細(xì)胞為模板進(jìn)行real-timePCR擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有檢測(cè)基因在ALV-J感染后5d和7d均發(fā)生下調(diào)，而在感染后6h和12h，除了TRAP1下調(diào)外其

10、它檢測(cè)基因均上調(diào)。DJ-1在感染初期上調(diào)后，一直處于下調(diào)狀態(tài)。UCHL1、VDAC1、TRAP1和HMGB1在感染后1-3d并沒(méi)有明顯的變化規(guī)律。TRAP1在感染后6h和2d下調(diào)超過(guò)10倍，而在感染后1d上調(diào)超過(guò)10倍。這些基因轉(zhuǎn)錄水平變化規(guī)律一方面部分驗(yàn)證了在二維電泳中各差異蛋白的變化，另一方面豐富了蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容，也為進(jìn)一步研究這些蛋白的功能提供了借鑒。
　　 4.雞源DJ-1蛋白的原核表達(dá)及多抗血清的制備
　　

11、 DJ-1與癌癥的發(fā)生和發(fā)展緊密相關(guān)，在一些腫瘤組織或細(xì)胞內(nèi)，DJ-1的表達(dá)顯著高于相鄰的外周組織或正常細(xì)胞。在禽白血病病毒J亞群(ALV-J)的早期感染的蛋白質(zhì)組研究中發(fā)現(xiàn)了DJ-1蛋白的上調(diào)。為了進(jìn)一步研究DJ-1蛋白在ALV-J感染中的生物學(xué)作用，從DF-1細(xì)胞的cDNA中擴(kuò)增DJ-1基因編碼區(qū)，連接T載體后克隆入pET-32a載體進(jìn)行原核表達(dá)，之后對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化并免疫BALB/c小鼠制備多抗血清。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:IPTG終