豬鏈球菌2型SLY與EF蛋白的原核表達(dá)及生物學(xué)特性鑒定.pdf

1、豬鏈球菌2型(Streptococcussuisserotype2，SS2)是世界范圍內(nèi)廣泛存在的一種重要的人畜共患性病原菌，可引起豬和人的關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、肺炎、敗血癥、中毒性休克綜合征甚至死亡。我國(guó)分別于1998年和2005年2次爆發(fā)SS2流行，造成大批豬群感染發(fā)病及數(shù)十人死亡，引起全球關(guān)注。SS2的致病機(jī)理、檢測(cè)和防治研究成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　 本研究PCR擴(kuò)增、克隆、原核表達(dá)了SS2的溶血素(suilysin，

2、SLY)和胞外蛋白因子(extracellularproteinfactor，EF)全長(zhǎng)基因，獲得可溶性的rSLY蛋白與rEF蛋白，分析了rSLY蛋白的溶血活性，制備了rSLY、rEF的亞單位疫苗，建立了SS2SLY、EF蛋白抗體的ELISA檢測(cè)方法，最后研究了rSLY與rEF對(duì)豬流感病毒毒力的影響。
　　 1.鏈球菌2型SLY、EF的原核表達(dá)及生物學(xué)活性分析
　　 以SS2菌HA9801株的全基因組為模板，PCR擴(kuò)增并

3、克隆豬溶血素(suilysin，SLY)和胞外蛋白因子(extracellularproteinfactor，EF)全長(zhǎng)基因，與原核表達(dá)載體pET-28a連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，收集表達(dá)菌體，超聲破壁、鎳柱純化獲得可溶性的rSLY蛋白與rEF蛋白。建立的rSLY原核表達(dá)體系能高效表達(dá)可溶性的具有溶血活性的rSLY，建立的rEF原核表達(dá)系統(tǒng)能高效表達(dá)可溶性的rEF。鎳柱純化制備的rSLY、rEF純度達(dá)電泳純，分子量約為54ku、11

4、0ku。100mL重組菌菌體能純化出約8mg電泳純的rSLY與10mg電泳純的rEF。rSLY具有高溶血活性，溶血比活為4057HU/mg。rSLY對(duì)多種動(dòng)物的紅細(xì)胞有溶血作用，對(duì)豬、兔和豚鼠的紅細(xì)胞溶血作用最強(qiáng)。rSLY在4℃保存溶血活性最穩(wěn)定，保存48h溶血活性不降低。在pH6-7和離子強(qiáng)度為500mmol/L時(shí)溶血活性最高。本研究獲得了高表達(dá)量、可溶性的、具有溶血活性的rSLY和大量可溶的rEF蛋白，首次系統(tǒng)研究了不同理化因素對(duì)r

5、SLY的生物學(xué)活性的影響，為SLY致病機(jī)理深入研究及SS2亞單位疫苗、診斷試劑的研制奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.鏈球菌2型SLY與EF蛋白亞單位疫苗研制及其免疫效力評(píng)價(jià)
　　 分別制備rEF、rSLY、rEF+rSLY、SS2全菌液的油乳劑滅活疫苗，背部皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭兔，間隔10d免疫2次，每隔10d采血分離血清，建立ELISA方法檢測(cè)亞單位疫苗的抗體消長(zhǎng)規(guī)律。結(jié)果表明，免疫亞單位疫苗以后，兔血清中產(chǎn)生了高滴度的相應(yīng)

6、特異性抗體，且抗體水平均符合抗體的消長(zhǎng)規(guī)律，即首免以后血液中的抗體水平逐漸升高，二免以后抗體又繼續(xù)增長(zhǎng)，大約10d左右達(dá)到最高值，并維持約30d，之后就逐漸下降，最后維持一定的水平。而全菌滅活苗刺激機(jī)體產(chǎn)生了較低水平的SLY與EF抗體。
　　 3.豬鏈球菌2型SLY與EF蛋白增強(qiáng)豬流感病毒毒力的研究
　　 rSLY、rEF分別與豬流感病毒作用，接種MDCK細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變和病毒增殖情況。豬流感病毒在rSLY蛋白的作用下