豬肝細胞黃嘌呤氧化還原酶代謝喹賽多的結構和功能研究.pdf

1、喹賽多是喹噁啉類抗菌促生長類飼料添加劑。早先上市的喹噁啉類藥物如卡巴氧和喹乙醇在上世紀中后期曾廣泛應用于養(yǎng)殖業(yè)的各個環(huán)節(jié)，但隨后的毒理試驗證明它們都具有明顯的三致作用，嚴重威脅動物和人類健康。目前的毒理研究已經(jīng)表明喹賽多的無光敏、致畸、生殖和蓄積毒性，在豬和雞的安全性非常高，可成為新的喹嗯啉類替代藥。目前關于喹賽多代謝酶的研究還很少見，而藥物的毒理、藥理作用都與其原型藥物在機體內的代謝及殘留息息相關，因此加強對喹賽多體內代謝過程中相關酶

2、的研究就顯得刻不容緩了。喹賽多代謝關鍵酶的研究不僅有助于喹賽多作為一類新獸藥的申報，更能指導喹賽多在食品動物中的合理使用，幫助制定合理的休藥期，從而避免了有害殘留的出現(xiàn)，為人類的食品健康保駕護航。
　　 黃嘌呤氧化還原酶(XOR)是含鉬類酶家族的一員，在動物體內各組織中分布廣泛，主要是參與哺乳動物體內次黃嘌呤代謝成黃嘌呤和黃嘌呤氧化代謝為尿酸的生理過程。XOR主要分布在組織細胞胞漿中，在肝細胞漿中展示了重要的氧化還原活性，是除P

3、450酶之外最重要的藥物代謝酶之一。XOR具有很強的還原代謝能力，主要參與了硝基、氮氧化物和硫氧化物等基團的還原。由于喹賽多1位和4位的氮氧化物的還原產(chǎn)物都是喹賽多在動物體內代謝的主要代謝產(chǎn)物，已有的研究證明了喹賽多跟豬胞漿蛋白孵育后會發(fā)現(xiàn)代謝，推測XOR極有可能在喹賽多的脫氧還原代謝中扮演重要角色。
　　 本研究首先用XOR特異性抑制劑確定XOR是喹賽多的代謝酶，然后克隆豬肝細胞XOR基因，并選擇合適的體外表達系統(tǒng)對豬XOR進

4、行重組表達，研究重組XOR的酶學性質。為了研究XOR催化喹賽多代謝的機理，利用同源建模和分子對接技術確定XOR代謝喹賽多的關鍵氨基酸殘基，利用定點突變技術，異源表達并鑒定突變體的代謝活性，展示關鍵氨基酸殘基對其代謝能力的影響，并分析XOR結構與功能的關系。
　　 1.豬XOR代謝喹賽多的驗證
　　 差速離心法制豬肝細胞胞漿蛋白，與喹賽多進行體外孵育，并用XOR特異性抑制劑作用，HPLC檢測代謝產(chǎn)物。
　　 體外代

5、謝試驗可以明顯的看到豬肝細胞胞漿蛋白代謝喹賽多，XOR特異性抑制劑作用后可以看到明顯的抑制作用，說明豬肝臟胞漿蛋白中的XOR可以代謝喹賽多。
　　 2.豬XOR基因的克隆、表達和活性鑒定
　　 用Trizole法提取肝細胞總RNA，反轉錄酶反轉錄獲得cDNA，再以cDNA為模板，參照其它哺乳動物同源性較高的序列設計引物，分兩段擴增XOR基因，然后酶切連接獲得完整CDs序列。用pFastBac HTb載體構建重組質粒，轉座

6、到桿粒中，然后轉染到桿狀病毒中，獲得含有XOR編碼序列的重組病毒。Sf9被桿狀病毒感染后表達XOR蛋白。Western blot驗證表達結果，蛋白膠灰度確定重組蛋白含量。測定XOR代謝動力學參數(shù)(最大初速度Vmax、米氏常數(shù)Km和體外清除率CLint)。
　　 表達載體pFastBac HTb-XOR酶切結果證明目的基因克隆成功，XOR編碼序列測序后上傳到NCBI核苷酸庫中，序列號是JN896312.1。重組蛋白體外代謝結果表明

7、，重組蛋白是以活性形式存在于Sf9細胞中。重組XOR代謝喹賽多的Km值是代謝黃嘌呤的2.7倍，而Vmax只有后者的1/5，對黃嘌呤的Clint值是喹賽多的近15倍。說明相對于喹賽多，豬XOR對黃嘌呤的結合能力更強，催化效率更高，代謝能力更強。
　　 3.豬XOR代謝喹賽多的關鍵氨基酸的確定
　　 利用分子生物學網(wǎng)站，分析蛋白質二級結構，并根據(jù)牛XOR晶體結構為模板進行同源建模。將喹賽多作為配體，XOR作為受體進行分子對接

8、，得到喹賽多代謝關鍵氨基酸殘基。
　　 二級結構預測結果顯示，豬XOR跟牛XOR的二級結構十分接近。結構域預測結果說明，該酶的功能區(qū)域保守性非常高，分別由含鐵硫中心的結構域(20kDa)、含F(xiàn)AD的結構域(40kDa)和含鉬輔助因子的結構域(85kDa)三部分組成。同源建模結果可信程度很高，對模型評價DOPE Score是-157326.5625，Verify Score為616.831。RamachandranPlot圖結果顯

9、示，91.5%氨基酸都分布在藍色最適區(qū)域，5.7%氨基酸位于紫色可信區(qū)域，2.8%氨基酸位于可疑區(qū)域。將喹賽多與XOR模型對接后找到與喹賽多發(fā)生相互作用力的G47、N352、S360、R427、D430、D431、S1227和K1230八個氨基酸殘基。這八個氨基酸距離喹賽多都不超過4A，其中R427、D431、S1227和K1230與喹賽多形成了氫鍵結合，其余四個氨基酸形成了其它非共價鍵結合。分子對接模擬結果顯示，這些氨基酸殘基都與喹賽

10、多催化過程息息相關，能顯著改變XOR對喹賽多的代謝能力。
　　 4.點突變對XOR代謝喹賽多的影響
　　 構建突變體表達載體，重組表達XOR突變體，并與喹賽多孵育評估突變對酶代謝喹賽多能力的影響。
　　 動力學分析結果顯示，XOR突變體代謝黃嘌呤時，D430H和D431A能增加CLint值，S360P、S1227A和K1230A能降低CLint值，說明這些氨基酸殘基與黃嘌呤代謝能力關系密切。同時，這些位點的突變也

11、改變了酶對底物親和性和Vmax值，D431A能顯著增加Vmax，S360P、S1227A和K1230A對黃嘌呤親和性明顯降低，說明這些位點與底物結合位點關系密切。XOR突變體代謝喹賽多結果顯示，XOR代謝喹賽多的能力不及代謝黃嘌呤1/10，R427E和D431A能增強CLint值，即能增強喹賽多代謝能力，S360P、D430H、S1227A和K1230A代謝喹賽多能力下降。R427E底物親和性明顯增強，S360P、S1227A和K123

12、0A的Km值明顯增大，說明底物親和性減弱明顯，這些都說明這些氨基酸殘基與喹賽多代謝作用相關。
　　 綜上所述，本研究在體外重組表達了喹賽多在豬體內的代謝關鍵酶-黃嘌呤氧化還原酶(XOR)，并對該酶進行了同源建模和分子對接模擬研究，確定了8個與喹賽多代謝相關的氨基酸。通過對這些氨基酸進行定點突變研究，一定程度上揭示了XOR代謝喹賽多的結構與功能關系及分子催化機制，為喹賽多在豬體內的代謝提供了理論依據(jù)。此外，本研究建立的重組酶體外代