馬流感病毒分離鑒定及甲病毒復(fù)制子載體疫苗的研究.pdf

1、馬流行性感冒(Equine influenza，EI)是由正粘病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感屬(Influenzavirus)中的馬流感病毒(Equine influenza virus，EIV)引起的一種急性接觸性呼吸道傳染病。該病在馬屬動(dòng)物中極易傳播，多呈暴發(fā)性流行，發(fā)病率高病死率低。EIV有兩個(gè)亞型，分別為H7N7和H3N8亞型。由于疫苗接種等防控措施，H7N7亞型EIV在馬群內(nèi)已經(jīng)消失很久，但是疫苗接種并沒(méi)有

2、有效地預(yù)防H3N8亞型EIV在世界范圍內(nèi)的蔓延。我國(guó)的EI疫苗市場(chǎng)一直處于空白，而進(jìn)口疫苗應(yīng)用的毒株都是上世紀(jì)90年代分離的流行毒株，隨著馬流感疫情在我國(guó)的不斷變化，亟需應(yīng)用在我國(guó)EI流行時(shí)分離到的毒株來(lái)制備馬流感疫苗。鑒于此，本論文通過(guò)對(duì)我國(guó)黑龍江省分離到的兩株EIV的遺傳演化規(guī)律的分析，總結(jié)現(xiàn)今在我國(guó)流行的EIV流行株的特點(diǎn)，選擇適合在中國(guó)作為疫苗株應(yīng)用的EIV分離株，制備能夠有效預(yù)防EI在我國(guó)蔓延的候選疫苗。
　　 本研究

3、采集發(fā)病馬匹的鼻拭子樣品，進(jìn)行病毒的分離鑒定。結(jié)果表明，兩種樣品的分離物均能夠在9-10日齡的雞胚上進(jìn)行盲傳，收集的尿囊液都具有血凝效價(jià)，穩(wěn)定傳代后病毒的血凝價(jià)分別達(dá)到256和128，病毒的EID50為108/mL和107.5/mL；通過(guò)對(duì)濃縮的雞胚尿囊液以及病毒在細(xì)胞上傳代之后的切片進(jìn)行電鏡觀測(cè)，能夠觀察到病毒粒子多成呈橢圓形(但也有不規(guī)則形狀)，病毒粒子的直徑為100nm，具有流感病毒的典型特征。通過(guò)對(duì)兩株病毒株的HA基因的擴(kuò)增和遺

4、傳進(jìn)化分析表明，該流感病毒的HA基因都與馬的流感病毒處于同一簇，為典型的馬流感病毒，并且分別命名為A/equine/Heilongjiang/1/2010和A/equine/Heilongjiang/1/2011，該株與A/equine/Xinjiang/3/07(H3N8)株同源性達(dá)99％，屬于H3N8亞型EIV美洲型佛羅里達(dá)Ⅱ型。為了研究我國(guó)馬流感病毒的遺傳變異情況，將兩株分離株與其他32株EIV的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，包括一些中國(guó)分

5、離到的毒株、外國(guó)毒株以及6株OIE推薦的疫苗株，結(jié)果表明，我國(guó)近年來(lái)分離的馬流感病毒為佛羅里達(dá)Ⅱ型的H3N8 EIV，與蒙古分離株A/Mongolia/1/2008同源性較近，這些病毒都起源于歐洲近年來(lái)流行的佛羅里達(dá)Ⅱ型EIV，但與日本分離株(A/equine/Tokyo/1/07)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，日本分離到的EIV毒株都屬于佛羅里達(dá)Ⅰ型EIV，同時(shí)與我國(guó)90年代分離的歐洲型EIV也處于明顯不同的進(jìn)化分支。
　　 為了制備出適合在

6、我國(guó)應(yīng)用的馬流感疫苗，根據(jù)上述分析的當(dāng)前我國(guó)馬流感病毒的遺傳變異特征，本研究選用在我國(guó)分離的毒株，歐洲型馬流感病毒A/equine/Qinghai/1/1994(H3N8)和美洲型馬流感病毒A/equine/Xinjiang/3/2007(H3N8)，作為疫苗株，擬用甲病毒復(fù)制子載體為基礎(chǔ)研制馬流感疫苗。分別構(gòu)建了表達(dá)上述兩種毒株的保護(hù)性抗原基因HA基因的兩種重組質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)酶切、PCR、測(cè)序和間接免疫熒光鑒定證實(shí)本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的兩種甲病毒復(fù)

7、制子重組質(zhì)粒能夠正確地表達(dá)外源基因。為進(jìn)一步研究該重組疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的保護(hù)效果奠定了基礎(chǔ)。
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證該重組甲病毒復(fù)制子載體疫苗的保護(hù)效果，我們將兩種DNA疫苗分組免疫小鼠，疫苗免疫后進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究所構(gòu)建的兩個(gè)重組質(zhì)粒在低劑量組時(shí)就可以誘生與常規(guī)型DNA載體疫苗高劑量組的免疫效果，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)病毒的抗體，抗體水平在加強(qiáng)免疫后明顯升高；復(fù)制型DNA疫苗免疫組均能引起CD4+T細(xì)胞以及CD4+T

8、/CD8+T的顯著上升；同時(shí)，在小鼠體內(nèi)也可引起IFN-γ、IL-2和IL-4水平的提高，尤以前兩者的升高更明顯；攻毒后，重組質(zhì)粒免疫組能夠保護(hù)小鼠抵抗流感病毒的攻擊，而對(duì)照組小鼠均感染馬流感病毒。
　　 本研究所構(gòu)建的重組質(zhì)粒于小鼠的免疫效力、體內(nèi)免疫反應(yīng)以及不同免疫劑量對(duì)免疫效果影響的評(píng)估，證實(shí)我們所構(gòu)建的表達(dá)H3N8亞型馬流感病毒的甲病毒復(fù)制子DNA疫苗能夠保護(hù)小鼠抵抗流感病毒的感染，為進(jìn)一步在馬體中進(jìn)行EIV免疫機(jī)理的探