植物病原真菌與昆蟲病原真菌侵染寄主表皮的分子機制研究.pdf

1、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是水稻最重要的傳染性真菌病害，作為病原真菌致病機理研究的模式物種，其分子致病機制已被深入研究，而金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）是研究昆蟲病原真菌致病機理的模式真菌，廣泛應(yīng)用于害蟲的生物防治。稻瘟病菌與綠僵菌分別侵染寄主表皮的過程十分相似，深入研究這兩種致病真菌，比較它們致病機制的異同，有助于闡明真菌侵染動植物的分子機制，可為植物真菌病害防治、殺蟲真菌農(nóng)藥研制提

2、供新的理論依據(jù)，對于植物病蟲防治有著十分重要的意義。
　　侵染寄主植物表皮過程中，稻瘟病菌依靠細胞自噬，降解并回收分生孢子內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)、細胞器等，從而為附著胞的發(fā)育成熟及膨脹壓的累積提供物質(zhì)保證。因此，揭示稻瘟病菌的細胞自噬相關(guān)分子調(diào)控機制，對于認識稻瘟病菌附著胞發(fā)育相關(guān)的分子機理、以及開發(fā)新的稻瘟病防治靶標具有重要意義。研究金龜子綠僵菌在寄主體表萌發(fā)、分化時期的基因表達情況，并與稻瘟病菌等植物病原真菌進行比較分析，能夠為挖掘蟲生

3、真菌基因資源、鑒定金龜子綠僵菌的重要毒力性狀基因、揭示其致病的分子機理提供豐富信息。
　　本文通過分析稻瘟病菌MoVAC8、MoTSC13、MoTOR2和MoATG1基因的功能，對稻瘟病菌侵染寄主植物表皮時細胞核降解的分子機理和自噬調(diào)控機理進行了研究。同時對綠僵菌侵染寄主蝗蟲體表時的基因表達進行了系統(tǒng)分析，比較了綠僵菌與稻瘟病菌之間致病機制的異同。
　?、儆嘘P(guān)稻瘟病菌的主要研究結(jié)果如下：
　　1）VAC8和TSC13是

4、酵母細胞核逐步微自吞（piecemeal microautophagy of nuclues，PMN）通路的關(guān)鍵基因，兩者在稻瘟病菌中的同源基因分別是MoVAC8和MoTSC13。酵母互補試驗和酵母熒光蛋白yEGFP標記試驗表明VAC8基因在稻瘟病菌和酵母之間具有一定的功能保守性，而 TSC13的基因功能在酵母與稻瘟病菌之間高度保守。
　　2）GFP熒光蛋白標記試驗表明，稻瘟病菌的MoVAC8蛋白定位于細胞液泡膜表面，而MoTSC

5、13分布在細胞核外膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面。GFP融合試驗表明MoVAC8蛋白的SH4結(jié)構(gòu)域在MoVAC8蛋白中發(fā)揮膜定位信號肽的功能。基因定點突變試驗表明，MoVAC8蛋白 SH4結(jié)構(gòu)域內(nèi)的肉豆蔻酰修飾位點甘氨酸（glycine）和3個棕櫚酰修飾位點半胱氨酸（cysteine）影響MoVAC8蛋白的正確膜定位以及蛋白參與咖啡因脅迫應(yīng)答的功能。
　　3）MoVAC8基因缺失突變體⊿Movac8對寄主水稻具有完全的致病能力，但對咖啡因高度敏

6、感。與野生型相比，MoTSC13基因缺失突變體⊿Motsc13突變體的營養(yǎng)菌絲生長和產(chǎn)孢能力下降，對滲透壓脅迫和細胞壁干擾劑的敏感性增加，突變體附著胞分化出侵染釘?shù)谋壤@著降低，并且侵染菌絲增殖能力下降，從而導致致病力降低。
　　4）紅色熒光蛋白RFP標記稻瘟病菌細胞核的熒光顯微觀察結(jié)果表明，細胞自噬突變體⊿Moatg1和⊿Moatg4在附著胞發(fā)育過程中，都不能順利降解分生孢子內(nèi)的細胞核，而突變體⊿Movac8和⊿Motsc13的

7、細胞核都可以正確降解。共表達MoVAC8:GFP和H1:RFP的稻瘟病菌轉(zhuǎn)化菌株、以及共表達 MoTSC13:GFP和H1:RFP的稻瘟病菌轉(zhuǎn)化菌株中，酵母 PMN通路的典型亞細胞結(jié)構(gòu)均不能被觀察到。以上結(jié)果表明，稻瘟病菌侵染相關(guān)的細胞核降解過程依賴于非選擇性自噬核心基因MoATG1和MoATG4，而與MoVAC8和MoTSC13的基因功能無關(guān)。
　　5）基因序列分析表明，MoTOR2編碼2469個氨基酸組成的蛋白，含有TOR蛋白

8、保守的結(jié)構(gòu)域，包括N端的HEAT重復單元和FAT結(jié)構(gòu)域，以及C端的FRB結(jié)構(gòu)域、激酶結(jié)構(gòu)域和FATC結(jié)構(gòu)域。GFP啟動子融合試驗和定量PCR試驗表明，MoTOR2基因在侵染階段和營養(yǎng)生長階段組成型表達。
　　6）MoFKBP12基因的缺失突變體⊿Mofkbp12的表型分析和酵母雙雜交試驗表明，雷帕霉素作為TOR蛋白的特異性激酶活性抑制劑，介導 MoFKBP12蛋白與MoTOR2蛋白FRB結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。雷帕霉素能夠抑制稻瘟病

9、菌營養(yǎng)菌絲的生長、附著胞發(fā)育過程中營養(yǎng)物質(zhì)的分解、細胞有絲分裂、分生孢子內(nèi)的細胞自噬體的減少、附著胞內(nèi)細胞自噬體的增加，并能刺激分生孢子分化形成多個附著胞。
　　7）以MoTOR2基因內(nèi)FRB和FAT結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)為RNAi干擾靶標，采用NaAc化學誘導基因沉默，成功下調(diào)了MoTOR2基因在營養(yǎng)菌絲生長以及附著胞發(fā)育過程中的表達水平。干擾轉(zhuǎn)化子的表型分析表明，MoTOR2調(diào)控分生孢子的細胞自噬和致病力。通過RNAi在附著胞中特異性

10、下調(diào)MoTOR2表達水平時，稻瘟病菌附著胞形成不受影響，但其對寄主的致病能力下降。MoTOR2及MoLST8基因在附著胞中同時特異超表達時，附著胞內(nèi)自噬體數(shù)量和稻瘟病菌的致病能力不受影響。
　　8）GFP熒光蛋白標記試驗表明，MoATG1蛋白廣泛分布在細胞質(zhì)中，并在一些區(qū)域富集呈點狀，這些點狀區(qū)域的數(shù)量變化趨勢與自噬體的數(shù)量變化趨勢相一致，并且GPF:MoATG1融合蛋白的點狀富集區(qū)域能與mRFP標記的自噬體部分共定位。MoATG

11、1基因定點突變試驗表明，MoATG1蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中與激酶活性相關(guān)的3個保守氨基酸在稻瘟病菌細胞自噬體的形成和致病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　?、谟嘘P(guān)蝗綠僵菌的主要研究結(jié)果如下：
　　1）構(gòu)建了綠僵菌侵染寄主蝗蟲體表階段的全長均一化 cDNA文庫，共挑取8215個文庫克隆進行測序，獲得7302條高質(zhì)量表達序列標簽序列（Expressed sequence tag，EST），聚類拼接為4739條unique ESTs，其中包括10

12、89條contigs和3650條singlets。
　　2）與綠僵菌基因組文庫的比對分析表明，4711條ESTs序列均由綠僵菌所表達，其中包括已報道的綠僵菌毒力基因。通過基因注釋和功能歸類，對unique ESTs進行生物學功能預測與分析，揭示了綠僵菌為適應(yīng)寄主體表環(huán)境所采用的多種基因表達策略，主要包括：降解昆蟲體壁成分、轉(zhuǎn)運胞外營養(yǎng)物質(zhì)至胞內(nèi)、調(diào)控碳源及氮源等代謝途徑、啟動信號傳導通路、合成及重建細胞壁結(jié)構(gòu)、胞吞和胞泌、調(diào)節(jié)細胞

13、周期及生長、對抗環(huán)境或宿主脅迫等。寄生菌-宿主相互作用數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果表明，參與以上生物學過程的許多綠僵菌同源基因很可能編碼重要的毒力因子。
　　3）半定量分析結(jié)果表明，隨機選取的44條參與不同生物學過程的綠僵菌ESTs均在附著孢形成時期表達，其中26條ESTs在基本培養(yǎng)基生長時期、蝗蟲后翅上附著胞形成時期以及蝗蟲血淋巴定殖時期都有表達，18條ESTs只在營養(yǎng)匱乏的基本培養(yǎng)基和蝗蟲后翅培養(yǎng)條件下表達，這表明綠僵菌在體表侵染階段和體內(nèi)

14、定殖階段通過差異調(diào)控某些基因來適應(yīng)不同的寄生環(huán)境。
　　4）稻瘟病菌 PLS1基因在附著胞分化形成侵染釘?shù)倪^程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。我們從所建的綠僵菌EST庫中直接克隆了綠僵菌PLS1同源基因的全長cDNA序列。通過菌落原位雜交，從綠僵菌基因組文庫中克隆了MaPLS1的全長基因序列，southern雜交表明MaPLS1在綠僵菌基因組中以單拷貝形式存在。對MaPLS1蛋白的序列特征、進化關(guān)系的分析表明，MaPLS1蛋白隸屬于真菌te

15、traspanin家族。
　　5）綠僵菌與稻瘟病菌等植物病原真菌在進化上具有親緣關(guān)系，綠僵菌與稻瘟病菌等植物病原真菌之間基因表達的比較分析表明，綠僵菌可能采用一些類似于植物病原真菌的基因表達策略或保守的功能基因來侵染寄主體表。
　　本文有關(guān)稻瘟病菌侵染相關(guān)的自噬分子機理、綠僵菌侵染寄主蝗蟲體表階段的基因表達策略、以及綠僵菌與稻瘟病菌等植物病原真菌之間侵染寄主分子機制的比較研究，深化了我們對兩種病原真菌侵染機理的認識，也為病原