PLZF對(duì)奶山羊雄性生殖干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、雄性生殖干細(xì)胞（male Germline Stem Cells，mGSCs）是定位于雄性動(dòng)物睪丸中的曲細(xì)精管基底膜上的成體干細(xì)胞。mGSCs不僅能夠通過(guò)自我更新來(lái)維持自身群體數(shù)量的穩(wěn)定，還可以通過(guò)定向分化產(chǎn)生精子，是唯一一種能夠通過(guò)自然生殖過(guò)程將雄性動(dòng)物的遺傳信息傳遞到下一代的成體干細(xì)胞。PLZF是一種高度保守的多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其表達(dá)具有嚴(yán)格的組織特異性和時(shí)序特異性，參與機(jī)體的發(fā)育、分化等多種重要的生物學(xué)過(guò)程。近年來(lái)，PLZF作為

2、非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，已引起人們的廣泛關(guān)注。PLZF表達(dá)于未分化的mGSCs，對(duì)其多能性的維持、自我更新和分化的平衡以及雄性個(gè)體的生育能力維持等具有重要的調(diào)控作用，是被廣泛認(rèn)可的mGSCs的標(biāo)志基因。目前，雖然對(duì)PLZF調(diào)控mGSCs自我更新和分化的作用及作用機(jī)制的探索已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但這些研究都是在小鼠等模式動(dòng)物中取得的。PLZF對(duì)山羊等家畜大動(dòng)物mGSCs的作用及作用機(jī)制卻知之甚少。本研究擬在已有基礎(chǔ)上，探索PLZF對(duì)奶山羊mGS

3、Cs生物學(xué)特性的的影響，以進(jìn)一步了解其對(duì)精子發(fā)生過(guò)程的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建PLZF超表達(dá)和干擾慢病毒載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)奶山羊mGSCs，并篩選得到了穩(wěn)定超表達(dá)和干擾PLZF的奶山羊mGSCs細(xì)胞株。并通過(guò)免疫熒光染色，qPCR，Western blot，EdU染色，流式細(xì)胞檢測(cè)等技術(shù)手段檢測(cè)了PLZF對(duì)奶山羊mGSCs多能性、自我更新、增殖、分化和凋亡等生物學(xué)特性的影響。
　　1.PLZF超表達(dá)載體及干擾載體的構(gòu)建和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)

4、胞株的篩選
　　我們構(gòu)建得到了PLZF慢病毒超表達(dá)載體pPLZF-CDH和PLZF慢病毒干擾載體pshPLZF。然后將慢病毒載體包裝病毒并轉(zhuǎn)導(dǎo)奶山羊mGSC，通過(guò)篩選、鑒定得到了超表達(dá)PLZF的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株mGSCs-oePLZF及其對(duì)照細(xì)胞株mGSCs-pCDH，干擾PLZF的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株mGSCs-pshPLZF及其對(duì)照細(xì)胞株mGSCs-pSIH。
　　2.PLZF促進(jìn)奶山羊mGSCs維持其自我更新和多能性并抑制其分化

5、>　　通過(guò)免疫熒光染色、qPCR和Western blot檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)GFRα1、Vasa、CD49fCD90、Oct4、Etv5等與mGSCs自我更新和多能性相關(guān)的基因表達(dá)顯著上調(diào)，而mGSCs的分化標(biāo)志基因c-Kit表達(dá)水平顯著下調(diào)。另外我們通過(guò)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Tet1表達(dá)水平顯著下調(diào)，同時(shí)Dnmt3a表達(dá)水平顯著上調(diào)，說(shuō)明PLZF可能促進(jìn)奶山羊mGSCs的DNA甲基化修飾。
　　3.PLZF抑制奶山羊mGSCs增殖，促進(jìn)其

6、凋亡
　　我們通過(guò)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、CCK8檢測(cè)、EdU染色、流式細(xì)胞周期檢測(cè)、免疫熒光染色、qPCR、Western blot等實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)PLZF的奶山羊mGSCs細(xì)胞增殖速度變慢、細(xì)胞周期在G0/G1期發(fā)生阻滯，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。通過(guò)細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，移植PLZF超表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的白消安模型小鼠睪丸要明顯比對(duì)側(cè)移植對(duì)照細(xì)胞的睪丸小，且曲細(xì)精管內(nèi)形成的細(xì)胞克隆也明顯比對(duì)照組差;相應(yīng)的，移植PLZF干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的睪