中華蜜蜂、意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A-,2-和透明質(zhì)酸酶基因的克隆與表達.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文中華蜜蜂、意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A和透明質(zhì)酸酶基因的克隆與表達姓名：沈立榮申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治指導(dǎo)教師：程家安張傳溪2002.4.1浙江大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要pBacFastHTa質(zhì)粒的棚應(yīng)的多克隆位點中，獲得重組桿狀病毒供體質(zhì)粒pBacHT—AcPLA2和pBacHTAmPLA2，然后分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHl0Bac，經(jīng)抗生素和藍白斑雙重篩選，PCR鑒定，獲重組病毒BacmidAcPLA2和Ba

2、cmid—AmPLA2。在無m清條件下，用Lipofectin介導(dǎo)BacmidAcPLA2和BacmidAmPLA2的基因組DNA轉(zhuǎn)染生長狀j態(tài)良好的粉紋夜蛾細(xì)胞Tn5BI一4后，分別從被二者感染的Tn細(xì)胞抽提病毒DNA進行PCR檢測，結(jié)果均得到與二者目的基因大小一致的片段。SDSPAGE電泳結(jié)果表明，被Bacmid—AcPLA2和Bacmid—AmPLA2感染的Tn細(xì)胞抽提物均有特異性蛋白條帶。薄層掃描定量分析結(jié)果表明，二者的特異性蛋

3、白(表達量)分別占Tn細(xì)胞總蛋白的532％和535％。用來源于意蜂蜂毒的AmPLA2(天然純AmPLA2)作抗原免疫家兔，獲得了效價很高的多克隆抗體，以此多克隆抗體作為一抗進行Westemblot檢測，AcPLA2和AmPLA2的表達產(chǎn)物均具有很強的免疫活性，在約18kD處與天然純AmPLA2同樣有明顯的陽性條帶，與預(yù)期目的蛋白分子量大小一致。用蛋黃(卵磷脂)作底物作生物活性測定，二者的表達產(chǎn)物均顯示類似于天然純AmPLA2及意蜂蜂毒的

4、PLA2酶活活性。這是AcPLA2和AmPLA2基因在桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)中的首次成功表達。通過PCR分別從pGEMAcPLA2和pGEMAmPLA2獲得目的基因，經(jīng)低熔點凝膠回收純化后，分別用平末端克隆策略插入pETBlue一1載體，構(gòu)建成大腸桿菌表達載體pET—AcPLA2和pET—AmPLA2，并在Tuner(DE3)placI菌株中進行了誘導(dǎo)表達。二者的表達產(chǎn)物在SDSPAGE中均呈特異性條帶，薄層掃描定量分析結(jié)果，二者的特

5、異性條帶蛋白(表達量)分別占菌體總蛋白的461％和432％。AcPLA2和AmPLA2基因的表達產(chǎn)物經(jīng)westernblot麓凹0均具有很強的免疫活性，在約15kD處均與天然純AmPLA2同樣有明顯的陽性條帶，與預(yù)期目的蛋白分予量大小一致。這是AcPLA2基因在大腸桿菌中的首次成功表達，也是對非人工合成的AmPLA2基因在大腸桿菌中的首次成功表達。(二)中華蜜蜂和意大利蜜蜂蜂毒透明質(zhì)酸酶基因的克隆與表達首先用RTPCR方法克隆成功中蜂蜂