產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌toxA基因克隆、表達(dá)及表達(dá)蛋白生物學(xué)特性研究.pdf

1、產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌(toxigenicPasteurellamultocida，T+Pm)是豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎(Swineprogressiveatrophicrhinitis，PAR)的主要病原菌。該菌分泌產(chǎn)生的多殺性巴氏桿菌毒素(Pasteurellamultocidatoxin，PMT)是一種約146kDa的皮膚壞死毒素。該毒素由toxA基因編碼，是T+pm的主要致病因子。PMT有很強(qiáng)的致病性，只注射少量提純的PMT就可以復(fù)制PA

2、R。鑒于PMT在PAR的產(chǎn)生過程中所起的重要作用，有關(guān)PMT的檢測便成為檢測PAR的關(guān)鍵。PMT的N端是粘附位點(diǎn)，C端是催化位點(diǎn)，中間區(qū)域?yàn)榭缒^(qū)，雖然PMT具有很強(qiáng)的致病性，但是部分缺失的PMT蛋白可以失去其致病性而保留免疫原性，這對于PAR疫苗的研制具有重要的意義。 本研究針對T+Pm的toxA基因及其表達(dá)產(chǎn)物開展了以下工作： 1、參照GenBank已發(fā)表的toxA基因序列，分別設(shè)計(jì)了針對T+PmtoxA基因及其3`

3、端的2對寡核苷酸引物。以本實(shí)驗(yàn)室分離保存的T+Pm菌株HN-13為實(shí)驗(yàn)材料，用PCR的方法成功擴(kuò)增toxA基因的全序列及其3`端基因片段C2115。對toxA基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，結(jié)果表明：該片段共4019bp，ORF為3858bp(登陸號：AY864768)；與GenBank上所報道的toxA基因序列核苷酸同源性都在99.8％以上。將擴(kuò)增的基因插入原核表達(dá)載體pGEX-KG，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-toxA。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)

4、化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)獲得大小約173kDa的表達(dá)蛋白(rPMT)。Westernblot檢測表明，表達(dá)蛋白具有良好的反應(yīng)原性。動物試驗(yàn)表明，以表達(dá)蛋白免疫的昆明小鼠，可以抵抗天然毒素致死劑量的攻擊。 2、為了更好的研究毒素蛋白的生物學(xué)活性，在所克隆的toxA基因的基礎(chǔ)上，用酶切的方法獲得了5個亞克隆片段：N1518、N3172、C2345、C2693和C3388。將上述5個基因片段和3’端基因片段C21

5、15插入pET-28a(b，c)載體系統(tǒng)，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果pET28b-C2115和pET28a-N1518重組質(zhì)粒獲得了高效表達(dá)，分別表達(dá)了toxA5’端的1518個堿基和3’端基因的2115個堿基。表達(dá)蛋白的大小分別約57kDa(rPMT-N)和78kDa(rPMT-C)，Westernblot檢測表明，兩種表達(dá)蛋白具有良好的反應(yīng)原性。 3、分別以rPMT-N和rPMT-C免疫大白兔，連續(xù)免

6、疫5次，每次間隔10d，并用瓊脂雙向擴(kuò)散試驗(yàn)檢測效價。結(jié)果，rPMT-N抗血清效價達(dá)1/32，rPMT-C抗血清效價達(dá)1/16。 4、以rPMT-N和rPMT-C的混合物為抗原，初步建立一種檢測PMT抗體的間接ELISA方法。經(jīng)方陣滴定確定抗原最佳包被濃度為1.6μg/mL、血清最佳稀釋倍數(shù)為1：40，陰陽性界限為OD630=0.291；用該方法檢測608份臨床送檢血清，結(jié)果表明陽性率達(dá)69.6％。 5、以rPMT、rP

7、MT-N、rPMT-C、及rPMT-N和rPMT-C的混合物分別與滅活的T+Pm(3.3×108個/mL)和支氣管敗血波氏桿菌(5×108個/mL)輔以白油乳化制成類毒素菌苗，并以該疫苗免疫本動物試驗(yàn)。檢測結(jié)果初步顯示，rPMT-N和rPMT可以用于制備PAR疫苗。 6、以我們實(shí)驗(yàn)室保存的T+Pm菌株HN-13為材料，繪制細(xì)菌生長曲線。結(jié)果表明，接種后3h進(jìn)入對數(shù)生長期；7h時進(jìn)入穩(wěn)定期；并于15h時逐漸轉(zhuǎn)入衰亡期。 本