亞洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的基因克隆、分離純化和性質(zhì)表征.pdf

1、β-N-乙酰己糖胺酶(EC3.2，1.52)廣泛分布于細(xì)菌、真菌、植物和動物體內(nèi)，負(fù)責(zé)水解多種糖復(fù)合物中以β-糖苷鍵連接的β-N-乙酰葡萄糖胺和β-N-乙酰半乳糖胺。昆蟲β-N-乙酰己糖胺酶由多個基因編碼，參與幾丁質(zhì)降解、N-糖基化修飾、糖復(fù)合物降解以及配子結(jié)合等生理過程。幾丁質(zhì)是由β-N-乙酰-D-葡萄糖胺(β-N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc)以β-1，4-糖苷鍵連接而成的線性多糖。由于幾丁質(zhì)是昆蟲重要的結(jié)

2、構(gòu)組分但在高等動植物體內(nèi)沒有分布，因此如果昆蟲體內(nèi)存在專一性參與幾丁質(zhì)降解的β-N-乙酰已糖胺酶，那么對該酶的選擇性抑制將為農(nóng)業(yè)害蟲防治提供新的思路。本研究旨在鑒定農(nóng)業(yè)害蟲亞洲玉米螟體內(nèi)專一性參與幾丁質(zhì)降解的β-N-乙酰已糖胺酶，為綠色農(nóng)藥的開發(fā)提供新的理論參考；同時對該酶性質(zhì)和機(jī)理的表征也能夠擴(kuò)展對于β-N-乙酰已糖胺酶乃至糖基水解酶的認(rèn)識。論文的主要研究工作包括：
　　 (一)亞洲玉米螟β-N-乙酰已糖胺酶的基因序列及轉(zhuǎn)錄水

3、平研究
　　 (1)根據(jù)已知昆蟲β-N-乙酰己糖胺酶的保守片段設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR及RACE的方法從亞洲玉米螟五齡幼蟲總RNA中獲得編碼β-N-乙酰已糖胺酶的基因序列(OfHEX1)，全長為2593 bp，編碼594個氨基酸，Genbank登錄號為DQ887769.1；
　　 (2)通過與已知晶體結(jié)構(gòu)的β-N-乙酰已糖胺酶進(jìn)行多重序列比對發(fā)現(xiàn)，Glu355、Asp240、His294、Asp354、Tyr450和T

4、rp424等關(guān)鍵氨基酸殘基在OfHEX1編碼的氨基酸序列中均保守。OfHEK1編碼的氨基酸序列與植物、鳥類和哺乳動物的β-N-乙酰已糖胺酶的一致性均為30％左右，但是與其它昆蟲β-N-乙酰已糖胺酶的同源性在27％-76％之間。系統(tǒng)樹分析顯示，昆蟲β-N-乙酰已糖胺酶可分為4個分支，推測分別對應(yīng)不同的生理功能。OfHEKI屬于分支IV，其同源性在48％-76％之間。該分支中的部分成員在幾丁質(zhì)降解過程中發(fā)揮作用。
　　 (3)利用R

5、T-PCR和Real-time PCR兩種方法研究OfHEX1在亞洲玉米螟不同生長發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄水平。發(fā)現(xiàn)OfHEX1在昆蟲蛻皮、成蛹和羽化等生長發(fā)育時期其轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。推測OfHEK1參與其變態(tài)過程中的幾丁質(zhì)降解。
　　 (二)亞洲玉米螟β-N-乙酰已糖胺酶的純化
　　 采用SOURCE30Q陰離子交換層析、CHT羥基磷灰石層析、MonoQ陰離子交換層析和Superdex200凝膠過濾層析等4步柱層析方法，從亞洲玉米螟

6、五齡幼蟲中分離純化了β-N-乙酰已糖胺酶(OfHexl)，產(chǎn)量為0.47 mg/300頭幼蟲，活力回收率為19.67％，純化倍數(shù)為1468倍。純化后的OfHexl經(jīng)SDS-PAGE分析為單一條帶，經(jīng)高分辨率凝膠過濾層析分析為單峰。
　　 (三)亞洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶的生物化學(xué)性質(zhì)表征
　　 (1) OfHex1的分子量和組成方式。在變性條件下，SDS-PAGE和MOLDI-TOF MS測定其分子量分別為68 kD

7、a和67.0±0.3 kDa。非變性條件下，凝膠過濾層析確定其分子量為128 kDa。該酶是以同源二聚體的形式存在并以非共價的形式結(jié)合。實(shí)驗(yàn)測定一對二硫鍵的連接方式為Cys36-Cys55。根據(jù)理論和實(shí)測分子量的差異推算每個亞基上存在1-2個N-糖基化修飾。
　　 (2) OfHex1的等電點(diǎn)為4.7。
　　 (3)通過肽指紋圖譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜確定了OfHex1部分氨基酸序列，證實(shí)該酶是由OfHEK1編碼的。
　　

8、 (四)亞洲玉米螟p-N-乙酰己糖胺酶的酶學(xué)性質(zhì)表征
　　 (1) OfHex1的最適pH為7，最適溫度為30℃。
　　 (2) OfHexl的最適底物為天然底物幾丁二糖((GlcNAc)2)，其Kcat/Km值為3069s-1mM·-1。該酶水解(GlcNAc)2的效率為已知β-N-乙酰己糖胺酶中最高，但是不能水解N-糖鏈底物GnGn-PA。OfHex1對于糖苷配基具有選擇性，水解速率比MU-β-GlcNAc/Mu-β

9、-GalNAc為1.53，Mu-β-GlcNAc/Mu-β-GlcNAc-6-SO4-為156.7。OfHex1的水解產(chǎn)物為β-構(gòu)型且不能水解不含乙酰氨基的底物Mu-β-Glc，說明該酶遵循底物輔助保留機(jī)理( substrate-assisted retaining mechanism)。OfHex1水解幾丁寡糖((GlcNAc)n)的速率隨(GlcNAc)n聚合度的升高而顯著降低，說明該酶是典型的外切糖基水解酶。OfHexl水解pNP

10、-β-(GlcNAC)3的初始產(chǎn)物為GlcNAc，說明該酶是從糖鏈的非還原端開始作用的。
　　 (4)與植物和人β-N-乙酰己糖胺酶相比，OfHexl對底物濃度的變化更敏感。經(jīng)驗(yàn)證，天然底物(GlcNAc)2對其的抑制遵循雙底物結(jié)合機(jī)理，其底物抑制常數(shù)Kis值為69μM。OfHexl不僅能被糖基水解酶20家族抑制劑2-ADN抑制，而且也能被糖基水解酶18家族抑制劑allosamidin抑制，Ki值分別為3.5μM和3.2 M。證