豬Mx1 cDNA分子的克隆、表達和鑒定.pdf

1、Mx蛋白是GTP酶發(fā)動蛋白超家族成員，是干擾素誘導產(chǎn)生的關(guān)鍵抗病毒蛋白。Mx蛋白能抑制許多病毒的復制，包括單鏈RNA病毒、雙鏈RNA病毒以及反轉(zhuǎn)錄病毒復制周期的早期階段。Mx蛋白有細胞核和細胞漿兩種形式，嚙齒類Mx1蛋白在胞核積聚，人的MxA、嚙齒類的Mx2和豬的Mx1蛋白定位于胞漿。胞核內(nèi)的Mx蛋白對甲型流感病毒等細胞核內(nèi)復制的病毒具有抑制作用，而胞漿內(nèi)的Mx蛋白能抑制水泡性口炎病毒、布亞病毒等胞漿內(nèi)復制病毒的增殖。 豬Mx蛋

2、白分為Mx1(76KD)和Mx2(73KD)，前者具有抗病毒活性，后者的抗病毒活性未見報道。本研究從經(jīng)IFN-a處理的豬外周血單個核細胞提取總RNA，根據(jù)己發(fā)表序列設(shè)計引物，用RT-PCR擴增得豬Mx1 cDNA。序列測定結(jié)果顯示，與已發(fā)表的豬Mx1 mRNA的核苷酸序列同源性為99.5％，氨基酸序列同源性為98.9％。將豬Mx1 cDNA克隆入真核表達載體pcDNA3.1/Zeo(+)，構(gòu)建重組表達載體pcDNA-Mx1。將豬Mx1

3、cDNA克隆入Bac-to-Bac()桿狀病毒表達系統(tǒng)的pFastBacl載體，用含桿狀病毒穿梭質(zhì)粒Bacmid和輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)座工程菌DH10Bac，獲得重組穿梭載體rBacmid-Mx1，將其DNA轉(zhuǎn)染，sf9昆蟲細胞，獲得了重組桿狀病毒rBac-Mx1，并經(jīng)免疫熒光試驗證明能在昆蟲細胞中正確表達豬Mx1蛋白。分別用重組質(zhì)粒pcDNA-Mx1轉(zhuǎn)染和重組蛋白處理狗腎MDCK細胞系，然后用水泡性口炎病毒感染，通過空斑形成減少試驗證明表達的M