豬CD8a基因的克隆表達(dá)及抗體的制備和鴿Ii鏈基因的克隆與鑒定.pdf

1、CD8分子是T淋巴細(xì)胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是T淋巴細(xì)胞重要的表面標(biāo)志物，它作為粘附分子、輔助受體和免疫調(diào)節(jié)物廣泛參與TCR對MHC分子遞呈抗原的識別和信號傳遞。CD8分子做為一類信號傳遞受體，其分子胞質(zhì)部分與非受體型蛋白酪氨酸激酶Src家族p56<'lck>相連，參與TCR介導(dǎo)的信號級聯(lián)反應(yīng)。CD8aa同型二聚體分子在小鼠腸上皮下與非典型MHC Ⅰ類分子作用，構(gòu)成腸道免疫屏障。為了解這種膜蛋白分子在機(jī)體特異性免疫應(yīng)答中的作用及其機(jī)理

2、，本研究進(jìn)行了豬CD8a基因的克隆、原核表達(dá)和多克隆抗體的制備。 首先，根據(jù)GenBank登錄的豬CD8a基因序列設(shè)計(jì)一對引物，從豬脾臟淋巴細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出一條特異性基因片段，經(jīng)單酶切鑒定，與GenBank中登錄的豬CD8a基因序列含有相同的單酶切位點(diǎn)。將其連接到pMD18-T載體后進(jìn)行序列測定。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)成功地克隆豬CD8a基因，它由711個核苷酸組成，編碼237個氨基酸。所克隆的豬CD8a基因與GenBank中登錄的

3、豬CD8a基因相比較，有6個核苷酸的差異，分別導(dǎo)致4個氨基酸的變化，同源性為99.2％。 其次，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)測定的豬CD8a基因序列和原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的多克隆酶切位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)一對引物，應(yīng)用PCR技術(shù)從重組質(zhì)粒pMD18-T-CD8a中擴(kuò)增出編碼豬CD8a前體蛋白的基因。PCR產(chǎn)物分離純化后連接到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的多克隆酶切位點(diǎn)，經(jīng)質(zhì)粒PCR鑒定和 EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定，篩選出陽性重組克隆，構(gòu)建

4、成CD8a基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1-CD8a。將這種原核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)0.6mmol/L IPTG的誘導(dǎo)在37℃表達(dá)，SDS-PAGE凝膠電泳表明所克隆的基因片段在大腸桿菌中得到表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物是以包涵體的形式存在的融合蛋白GST-CDSa，且所獲得的融合蛋白分子量約為52 KD，與預(yù)期結(jié)果相符。 最后，通過優(yōu)化原核表達(dá)條件，確定了重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-CD8a的原核表達(dá)最佳誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑

5、濃度，并用優(yōu)化后的條件對含有pGEX-4T-1-CD8a質(zhì)粒的BL21菌進(jìn)行了大量誘導(dǎo)表達(dá)。使用反復(fù)凍融和超聲方法來裂解表達(dá)菌，結(jié)合十二烷基肌氨酸鈉法，提取了大量的可溶性GST-CD8a融合蛋白。在對目標(biāo)蛋白進(jìn)行復(fù)性和親和層析純化之后，用其免疫小鼠，制備了針對該蛋白的鼠多克隆抗體，ELISA和WesternBlotting證明所制備的多克隆抗體具有免疫活性和生物學(xué)活性。 綜上所述，本研究成功地克隆了豬CDSa基因，對其進(jìn)行了原核

6、表達(dá)，獲得了大量的GST-CD8a融合蛋白，并制備了針對該融合蛋白的多克隆抗體，這些都為進(jìn)一步研究豬CD8a分子免疫學(xué)功能及其應(yīng)用提供了試驗(yàn)材料。 抗體制備恒定鏈 (invariant chain，Ii) 是一種非多態(tài)性Ⅱ型跨膜糖蛋白，主要表達(dá)于哺乳動物和禽類的體細(xì)胞表面，如B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、胸腺上皮細(xì)胞等。Ii鏈作為MHC Ⅱ類分子的伴侶蛋白，它主要有以下功能：輔助MHCⅡ類分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行正確折疊并遷移出內(nèi)

7、質(zhì)網(wǎng)；提供MHCⅡ類分子進(jìn)入內(nèi)體/溶體的靶信號；阻止MHCⅡ類分子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)源性抗原結(jié)合。因此，Ii鏈在MHCⅡ類分子呈遞外源性抗原給CD4<'+> T淋巴細(xì)胞的過程中起著關(guān)鍵性作用，對于機(jī)體的免疫應(yīng)答具有重要意義。 目前釣取未知基因的cDNA序列并克隆其全長的方法主要有兩種，分別是：cDNA文庫篩選法和快速cDNA末端擴(kuò)增法(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)。cDNA文庫篩選法煩瑣

8、、工作量大、費(fèi)用昂貴；而RACE技術(shù)靈敏、快速。鑒于Ii基因在免疫學(xué)中具有重要的意義及RACE法在釣取未知基因中的優(yōu)越性，我們采用RACE法，首次成功釣取了鴿子Ii基因，分析比較禽Ii鏈在進(jìn)化上的保守性，初步探討了鴿Ii鏈的功能和性質(zhì)。根據(jù)GeneBank登錄的禽類及哺乳動物的Ii鏈基因cDNA序列，用CodenHOP5設(shè)計(jì)一對簡并引物，用于擴(kuò)增鴿Ii鏈中保守性最高的區(qū)域；在該保守區(qū)中設(shè)計(jì)YRACE的上游引物，結(jié)合mRNA在3’端具有P

9、oly尾的特點(diǎn)，使用3′RACE試劑盒擴(kuò)增鴿Ii鏈的3′端；再以鴿Ii鏈的3′端核酸序列為模版設(shè)計(jì)一條磷酸化引物和3條半套式PCR引物，采用5′RACE試劑盒擴(kuò)增鴿Ii鏈的5′端。之后將3′RACE和5′RACE擴(kuò)增的結(jié)果用軟件拼接初步得出全序列，依照拼接結(jié)果設(shè)計(jì)全序列上、下游引物，擴(kuò)增克隆了鴿Ii鏈的全長cDNA基因。序列分析結(jié)果表明，鴿Ii基因全長cDNA序列為1050bp(登錄號：AY904337)，它與哺乳動物的Ii鏈功能區(qū)相似