龍馬微丸的體外溶出度研究-藥學畢業(yè)論文.

1、<p><b>　　湘潭大學畢業(yè)論文</b></p><p>　　題 目：龍馬微丸的體外溶出度研究 </p><p>　　學 院： 化學學院 </p><p>　　專 業(yè)： 藥 學 </p><p>　　學 號： 2

2、010601017 </p><p>　　姓 名： 徐 玉 靈 </p><p>　　指導教師： 吳萍 講師 </p><p>　　完成日期： 2014年 5 月 29日 </p><p><b>　　湘 潭 大 學</b></p>

3、;<p>　　畢業(yè)論文（設計）任務書</p><p>　　論文（設計）題目： 龍馬微丸的體外溶出度研究 </p><p>　　學號： 2010601017 姓名： 徐玉靈 專業(yè)： 藥 學

4、 </p><p>　　指導教師： 吳萍 系主任： 彭圣明 </p><p>　　一、主要內容及基本要求 </p><p>　　1．掌握微丸制劑相關知識，查閱文獻同時結合課堂所學了解微丸制劑，

5、重點掌握微丸的研制過程以及體外溶出度。 </p><p>　　2．通過查閱文獻了解龍馬自來丹的相關應用知識，包括化學成分、物理化學性質、藥理作用、毒理作用、臨床應用等，在理解文獻資料的基礎上根據(jù)自身專業(yè)知識設計實驗方案，并能在做實驗的過程中發(fā)現(xiàn)問題并及時的通過各種渠道解決問題。重

6、點掌握馬錢子的性質，特別是馬錢子堿的檢測方法，以及高效液相色譜儀器的使用方法。 </p><p>　　3．實驗過程中需要掌握實驗的基本操作方法，提高動手能力，提高處理突發(fā)事件的能力，增強實驗中的安全意識。結果分析過程中要求掌握分析儀器的使用方法，并能對數(shù)據(jù)進行全面的分析，得出正確的結論。

7、 </p><p>　　4．掌握科技論文的寫作方法，撰寫合格的畢業(yè)論文。 </p><p><b>　　二、重點研究的問題</b></p><p>　　1．確定檢測物質，優(yōu)化高效

8、液相色譜儀器條件，以及樣品去蛋白處理的方法。 </p><p>　　2． 參照2010年版《中國藥典》及相關文獻確定馬錢子堿含量測定方法。 </p><p>　　3．確定龍馬微丸的溶出規(guī)

9、律，計算龍馬微丸的累積溶出量，做原藥材對比實驗，考察成丸后的龍馬微丸的溶出特性變化，用不同溶出介質做溶出實驗，考察不同溶出環(huán)境對龍馬微丸溶出度的影響。 </p

10、><p><b>　　三、進度安排</b></p><p>　　四、應收集的資料及主要參考文獻</p><p>　　1.李明輝，李鳳琴，王廣林．三波長分光光度法測定壯筋骨膠囊中的士的寧的含量[J]．時珍國藥研究，1995，6(3)；17.

11、 </p><p>　　2.羅晉萍，張中蘇，連云嵐，等．薄層掃描法測定金龍祛痹丸中士的寧的含量口]．藥物分析雜志，1999，19(3)：179—180． </p><p>　　3.王琳，薛玉梅．薄層掃描法測定暈復靜片中士的寧含量

12、[J]．基層中藥雜志，1999，13(2)：9．</p><p>　　4.陳勇，黃敏，陸中海，等．十一藥酒的質量控制研究[J]．廣西中醫(yī)藥，2002，24，25(2)：57—59. </p><p>　　5.姬

13、生國，王東，李娥，等．三鼎丹膠囊中士的寧的含量測定[J]．時珍國醫(yī)國藥，2006，17(1)j 64—65． </p><p>　　6.張錚．HPLC法測定暈復靜片中士的寧和馬錢子堿的含量[J]．安徽醫(yī)藥，2003，7(3)：214—216．&l

14、t;/p><p>　　7.楊安東，馬艷，吳詩慧，等．骨痛寧搽劑的質量標準研究[J]．中成藥，2005，27(12)：1400—1404．</p><p>　　8.張凌云，張翔，馮慧憑．RP—HPLC法測定伸筋丹膠囊中士的寧和馬錢子堿的含量[J]．江蘇藥學與臨床研究，2004，lZ(3)：32—34．

15、 </p><p>　　9.王冬月，陳軍，蔡寶昌.馬錢子堿血藥濃度測定方法的優(yōu)化與應用[J].中國中藥雜志，2013，7:1075～1078 </p><p>　　10.國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典2010版二部[

16、M].2012年10月1日。正文第21頁。 </p><p>　　11.李彥超，蔡寶昌，李偉東，狄留慶.馬錢子總生物堿的測定及其提取條件的正交設計優(yōu)選[J].中藥新藥與臨床藥理,2004(1)15. </p><p>　　12.湯淮波，張令君,李湘玲,孫成風，

17、馬丕江.不同溶劑提取馬錢子中士的寧與馬錢子堿的實驗研究[J].中醫(yī)藥導報,2009，15(11)122~125. </p><p>　　13.付麗佳，王玉華。當歸補血丸中阿魏酸溶出度測定[J]。中國實驗方劑學雜志.2013,15(3)188~191.</p><p>　　14.

18、 姚彤煒編著。體內藥物分析[M]。浙江大學出版社。2001年01月第1版,第49頁 </p><p><b>　　湘 潭 大 學</b></p><p>　　畢業(yè)論文（設計）評閱表</p><p>　　學號 2010601017 姓名 徐 玉 靈 專業(yè) 藥 學

19、 </p><p>　　畢業(yè)論文（設計）題目： 龍馬微丸的體外溶出度 </p><p><b>　　湘 潭 大 學</b></p><p>　　畢業(yè)論文（設計）鑒定意見</p><p>　　學 號： 2010601017 學生姓名： 徐 玉 靈 專

20、 業(yè)： 藥 學 </p><p>　　畢業(yè)論文（設計說明書） 19 頁 圖 表 16 張</p><p><b>　　目錄</b></p><p>　　摘要...................................................

21、..........................................................2</p><p><b>　　一、引言3</b></p><p>　　1.龍馬自來丹簡介3</p><p>　　2.馬錢子成分測定的研究進展3</p><p>　　2.1分光光度法3</p&

22、gt;<p>　　2.2薄層掃描法4</p><p><b>　　2.3色譜法5</b></p><p><b>　　2.4其他方法5</b></p><p>　　3.本文的主要研究內容及意義6</p><p><b>　　二、實驗7</b></p

23、><p><b>　　2.1實驗材料7</b></p><p>　　2.1.1實驗儀器7</p><p>　　2.1.2實驗主要試劑7</p><p>　　2.2分析方法的建立7</p><p>　　2.2.1色譜條件優(yōu)化7</p><p>　　2.2.2 指標物質選

24、擇8</p><p>　　2.2.3標準曲線的繪制9</p><p>　　2.2.4去蛋白方法10</p><p>　　2.1.5地龍粉陰性對照試驗11</p><p>　　2.1.6精密度及溶液穩(wěn)定性試驗11</p><p>　　2.2自制龍馬微丸的含量測定12</p><p>　

25、　2.2.1提取方法12</p><p>　　2.2.2含量計算12</p><p>　　2.3龍馬微丸溶出實驗13</p><p>　　2.4中藥原材料對照實驗14</p><p>　　2.5不同溶出介質的影響15</p><p><b>　　三、結論16</b></p>

26、<p>　　3.1關于分析方法的結論16</p><p>　　3.2自制龍馬微丸溶出規(guī)律及特性的結論16</p><p><b>　　四、 討論16</b></p><p>　　4.1關于分析方法的討論16</p><p>　　4.2自制龍馬微丸溶出規(guī)律及特性的討論17</p>&l

27、t;p><b>　　參考文獻18</b></p><p><b>　　致謝19</b></p><p>　　龍馬微丸的體外溶出度研究</p><p><b>　　中文摘要</b></p><p>　　目的：考察龍馬微丸的體外溶出度，并對其釋藥特性進行探討。</p

28、><p>　　方法：采用高效液相色譜測定龍馬微丸的溶出樣品，確定去蛋白處理后樣品的液相條件。在不同溶出介質條件下考察不同環(huán)境對龍馬微丸溶出度的影響，并對比馬錢子粉及馬錢子與地龍的混合粉溶出規(guī)律,考察成丸后的龍馬微丸的溶出規(guī)律。</p><p>　　結果：液相條件：流動相為甲醇—水（含1%甲酸+0.3%三乙胺）（25:75），選馬錢子堿為檢測物質；自制龍馬微丸溶出迅速，酸性介質有利于龍馬微丸馬錢

29、子堿的溶出。</p><p>　　結論：該溶出度測定分析方法簡便易行，準確可靠，可以用于龍馬微丸的質量控制。</p><p>　　關鍵字：龍馬微丸，高效液相，溶出度</p><p>　　In vitro dissolution rate of the Homemade Longma Pellets</p><p><b>　　Abs

30、tract</b></p><p>　　Objective:To investigate the vitro dissolution rate of Longma pellets ;And explore its release characteristics.</p><p>　　Methods: HPMC was used as the matrix material ？t

31、o determinate the dissolution of the sample Longma pellets;to determine the liquid condition of the sample that protein has been processed. to investigate the influence of the vitro dissolution rate of Longma pellets und

32、er different conditions:</p><p>　　Results:HPLC Conditions：the suitable mobile phase is methanol---water (Containing1%triethylamine and 0.3%formic acid); the Homemade Longma Pellets have the rapid dissolution

33、 rate,and acidic environment helps the dissolution of the Homemade Longma Pellets.</p><p>　　Conclusion:The established dissolution method was accuracy，sensitive and simple．It can be used for quality control

34、of the Homemade Longma Pellets.</p><p>　　Key words:Longma pellets,HPLC,Dissolution</p><p><b>　　請仔細核對英文摘要</b></p><p><b>　　一、引言</b></p><p><b&g

35、t;　　1.龍馬自來丹簡介</b></p><p>　　龍馬自來丹的處方來源于《醫(yī)林改錯》卷下。書中記載的功能主治為癇癥。藥物組成：馬錢子8兩，地龍8條（去土，焙干為末)，香油1斤。將香油入鍋內熬滾，入馬錢子炸之，待馬錢子微有響爆之聲，拿1個用刀切兩半，看其內以紫紅色為度，研為細末；再入前地龍末和勻，面糊為丸，如綠豆大。用法用量：每服3-4分，臨臥以鹽水送下。如不為丸，面子亦可服。該藥對癇癥的治愈率極

36、高，一直沿用至今。</p><p>　　隨著現(xiàn)代藥理學研究的發(fā)展，研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)龍馬自來丹可以運用到其他的疾病上，與此同時，通過適當?shù)匦薷呐浞?、改變劑型使得龍馬自來丹的應用又有了新的進展。</p><p>　　馬錢子成分測定的研究進展</p><p>　　馬錢子為馬錢子科植物馬錢Strychnos nuxvomica L. 或云南馬錢Strychnos pierr

37、ana A. W. Hill 的干燥成熟種子，是常用中藥。具有通絡止痛、散結消腫之功效。士的寧、馬錢子堿是馬錢子及其制劑的有效成分，通常作為馬錢子及以馬錢子為主要處方成分的復方制劑分析的指標物質，我國醫(yī)藥研究者在馬錢子及其制劑中化學成分的測定做了很多工作，使馬錢子及其制劑的分析技術更加精確成熟。查閱文獻資料，現(xiàn)將幾年來馬錢子成分測定的研究進展做簡要總結如下。</p><p><b>　　2.1分光光度法

38、</b></p><p>　　2.1.1紫外分光光度法</p><p>　　利用士的寧、馬錢子堿分別在255、264nm處有最大吸收而測定其含量。黃馳等采用薄層色譜法在硅膠GF254板上分離得到的士的寧，再用紫外分光光度法測定，計算其中的含量。</p><p>　　2.1.2 雙波長法</p><p>　　特點是用一個吸收池和兩束

39、不同波長的光進行測定。通常干擾組分吸收光譜在這兩個波長處具等同吸收，可消除共存組分的干擾。有研究者將暈復靜片經適當溶媒提取后，分別測定在λ262nm，λ300nm處的吸光度，計算士的寧含量。還有報道用此法測定風濕馬錢片中士的寧的含量和金錢白花蛇藥酒中士的寧的含量。</p><p>　　2.1.3 三波長法</p><p>　　根據(jù)選定干擾組分吸收光譜上為一條直線的3個不同波長，利用比例關系

40、消除干擾組分對測定的影響。李明輝等配置適當濃度的士的寧及馬錢子堿的標準溶液及不含馬錢子的空白壯筋骨膠囊樣品提取液，并將上述3種溶液于210～320nm波長掃描，計算馬錢子堿及陰性樣品在3個波長處吸光度成一條直線，224nm，264nm，267nm為測定壯筋骨膠囊中士的寧含量的精選測定波長測定士的寧的含量。</p><p>　　2.1.4 正交函數(shù)分光光度法</p><p>　　以士的寧及馬

41、錢子堿在240~290nm 波長區(qū)間內呈二次吸收曲線，故采用二次正交多項式為特征多項式，以264nm，269nm，284nm 和298nm 的幾個測試點，按P=5A1一A2—4A3— 4A4一A5+5A6計算各式中間波長P值，通過P值轉換曲線，選擇276.5nm為測定士的寧的中間波長測定壯筋骨膠囊，回收率99．3％。</p><p><b>　　2.2薄層掃描法</b></p>

42、<p>　　2.2.1單波長反射法鋸齒掃描</p><p>　　羅晉萍等以甲苯一丙酮一乙醇一濃氨液(30：20：3：1)為展開劑，測定波長為254nm，對金龍祛痹丸中士的寧的含量進行測定。點樣量在0.54～3.21腭范圍內線性關系良好。報道用硅膠GF254薄層板，環(huán)已烷一氯仿一甲醇(7．5：4：1)為展開劑，在256nm波長測定骨刺膠囊中士的寧含量，結果點樣量在1．10～5．50µg范圍內與

43、積分值呈線性關系，平均回收率為100．16％ 。</p><p>　　2.2.2雙波長薄層掃描法</p><p>　　王琳等用雙波長反射法鋸齒形掃描測定暈復靜片中士的寧含量。用硅膠GF254，展開劑為甲苯一丙酮一乙醇一濃氨(8:6:0.5:0.5)λ=245nm，λ=300 nm，Sx=30；點樣量在0.536~3.216µg范圍內呈良好的線性關系。陳曉斌等用雙波長薄層掃描法測定

44、風濕痹痛丸士的寧、馬錢子堿、烏頭堿的含量。測定波長503nm，參比波長550 nm，結果面積積分平均值為47519．17，標準差為762．37，平均回收率士的寧99．9％。陳勇等在十一方藥酒的質量控制研究中測定馬錢子堿和士的寧的含量，結果λ=500nm，λ=650nm，Sx=3士的寧含量在1.063～5.315µg之間，點樣量與峰面積呈良好線性關系。姬生國等以甲苯：丙酮：乙醇：濃氨溶液(16：12：1：4)的上層溶液為展開劑，

45、在λ=254nm，λ325nm，測定三鼎丹膠囊中士的寧的含量，結果在1.026~5.130µg之間，線性關系良好，樣品平均回收率為99．5％。</p><p><b>　　2.3色譜法</b></p><p>　　2.3.1薄層掃描法( TLCS)</p><p>　　在各類色譜分析中TLCS 使用頻率最高，普遍采用的是雙波長反射法鋸

46、齒形掃描。該方法使用薄層厚度不同而引起的基線噪音得到補償，又可克服斑點不規(guī)則而引起的誤差。定量方法分外標法和內標法。對其馬錢子的中成藥制劑( 馬錢子散、滋陰補腎丸、養(yǎng)血祛風丸、傷科七味片、益髓沖劑) 用甲苯-丙酮-乙醇-氨水系統(tǒng)在硅膠G板展開，紫外燈( 254nm) 定位，雙波長鋸齒反射掃描對馬錢子堿和士的寧進行分離和含量測定，可有效控制藥品質量，且結果準確。士的寧、馬錢子堿是風濕痹痛丸中的有效成分，也是其毒性成分，用硅膠G板，正丁醇-

47、苯-乙酸乙酯-甲醇-氨水( 20.3:14.5:23:1.5:30) 展開 0. 05 mol/L 硫酸-碘化鉍鉀試液顯色，鋸齒反射掃描外標兩點法定量測定其制劑中馬錢子堿、士的寧含量，回收率分別為99. 0%，99. 9%。九分散中麻黃、馬錢子、乳香和沒藥組成，經氯仿-甲醇-氨水展開，雙波長鋸齒反射掃描測定士的寧、馬錢子堿和麻黃堿。對中藥馬錢子提取液用高效硅膠GF薄層板，反射直線掃描，以λ260nm 為測定波長λ355nm 為參比波長

48、在線形范圍1.0~5.0pg/ml 內測其含量。</p><p>　　2.3.2 高效液相色譜法(HPLC)</p><p>　　HPLC以經典液相色譜法為基礎：引入氣相色譜理論及實驗方法，流動相采用高壓輸送，采用高效固定相及在線檢測手段而發(fā)展起的分離分析方法。因其不受物質沸點，熱穩(wěn)定性，有機物或無機物的限制，具有適用范圍廣分離效率高，分析速度快，靈敏度高等特點。所以，近年來，該法已廣泛用

49、于中草藥及其制劑化學成分分離，鑒定及含量測定。王冬月等以0．01 mol/L 庚烷磺酸鈉與0．02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合溶液(10％ 的磷酸調節(jié)pH2．8)，乙腈(76：24)為流動相264為檢測波長，正相HPLC法測血液中馬錢子堿的濃度，用此法避免了采用反相HPLC 法測定士的寧和馬錢子堿含量時色譜峰拖尾嚴重，分析分離時間長的缺點， 其結果與1995 版《中國藥典》其含量測定比較，結果準確，精密度高。楊安東等在骨痛寧搽劑的質量

50、標準研究中采用高效液相色譜法對方中淫羊藿中淫羊藿昔、馬錢子中士的寧進行含量測定。結果：士的寧在0．4～4．8 µg范圍內線性關系良好。張凌云等用RP—HPLC法測定伸筋丹膠囊中士的寧和馬錢子堿的含量，采用Hypersil C18色譜柱(4．6ram×200mm，10µm)，水一乙腈(80：20)(</p><p><b>　　2.4 其他方法</b></p

51、><p>　　4．1 毛細管區(qū)帶電泳法</p><p>　　姜堯舜等應用本法對伸筋丹膠囊中士的寧和馬錢子堿成分進行了分離研究。采用pH=6.0,0.2mol／L磷酸溶液作為緩沖液；運行電壓20kV；檢測波長為260nm，被測成分可得到較好分離。用內標法測定其含量，在0.02～0.15mg／ml范圍內，士的寧和馬錢子堿均與內標峰面積之比呈良好線性關系，平均回收率分別為95.1％和96.4％。&l

52、t;/p><p>　　4．2 流動注射化學發(fā)光分析法</p><p>　　朱龍等利用馬錢子堿、士的寧和麻黃類生物堿在KMnO4-H+-還原體系中的化學發(fā)光(CL) 行為而更建立起來的分析方法，并將此與HPLC 聯(lián)用實現(xiàn)上述物質的選擇性測定，目前，此法已用于一些藥物中馬錢子堿等生物堿的測定。</p><p>　　4．3 硅膠柱準離子交換色譜法</p><

53、;p>　　此法對馬錢子及其炮制品馬錢子中士的寧含量測定，并與《中國藥典》收載的計算分光光度法進統(tǒng)計對比。本法簡便、準確、重現(xiàn)性好，不受其它成分干擾；經配對比較t檢驗法進行統(tǒng)計，測定結果與分光光度法差異有極顯著性(P<O．O1)。</p><p>　　3.本文的主要研究內容及意義</p><p>　　龍馬自來丹是來源于《醫(yī)林改錯》卷下的一味古方，功能主治為癇癥，現(xiàn)代臨床應用研究其

54、對類風濕性關節(jié)炎、小兒癇癥、神經根型頸椎病等疾病有較好的療效。微丸是指直徑小于 2.5 mm 的各類球形或類球形的制劑，具有外形美觀、流動性好、比表面積大、生物利用度高等特點。中藥微丸包衣后可掩蓋不良氣味，減少某些藥物刺激性，增加藥物穩(wěn)定性，特別是改善中藥浸膏易吸潮的特性，還可通過包衣制成緩控釋劑型，服用方便，且能降低藥物的毒副作用。</p><p>　　本課題組組成員通過擠出滾圓制粒法將龍馬自來丹制備成中藥復方

55、微丸，本實驗旨在探究成丸后的龍馬微丸其體外溶出度及釋藥特性，建立自制龍馬微丸溶出度的測定方法，以全面評價龍馬微丸的特性。</p><p><b>　　二、實驗</b></p><p><b>　　2.1實驗材料</b></p><p><b>　　2.1.1實驗儀器</b></p>&l

56、t;p>　　電子天平,長沙湘平科技發(fā)展有限公司，型號：ES-HA。</p><p>　　分析天平，余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司，型號：MB-2003。</p><p>　　遠紅外快速恒溫干燥箱，上海醫(yī)療越進醫(yī)療器械廠，型號：YHG-600BS。</p><p>　　藥物溶出試驗儀，天津市正通科技有限公司，型號：DT-8。</p><p&g

57、t;　　高效液相色譜儀，日本島津有限公司，型號：LC-20A。</p><p>　　智能恒溫磁力攪拌器，河南愛博特科技發(fā)展有限公司，型號：ZNCL-G。</p><p>　　微型渦旋混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司，型號：60227。</p><p>　　2.1.2實驗主要試劑</p><p>　　乙腈，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：

58、20140214，500ml/瓶。</p><p>　　甲醇，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20130610,500ml/瓶。</p><p>　　生馬錢子，株洲市榮康飲片廠。</p><p>　　地龍，株洲市榮康飲片廠。</p><p>　　氫氧化鈉，天津市復興科技發(fā)展有限公司，批號：20111108,500g/瓶。</p>

59、<p>　　馬錢子堿標品，中國食品檢定研究院，批號：9U7Z—HJPD，200mg/瓶。</p><p>　　三氯甲烷，天津市富宇精細化工有限公司，批號：110601，500ml/瓶。</p><p>　　冰醋酸，長沙湘科精細化工廠，批號：20100307，500ml/瓶。</p><p>　　無水醋酸鈉，廣東省臺山市化工廠，批號：20090712,50

60、0g/瓶。</p><p>　　2.2分析方法的建立</p><p>　　2.2.1色譜條件優(yōu)化</p><p>　　色譜柱：Intersustain C柱（4.6 mm×250 mm,5μm）。參照中國藥典2010年版（一部）化學成分分析，馬錢子檢測指標物質可選擇士的寧、馬錢子堿，檢測波長分別為254nm、264nm。 </p><

61、p>　　參考相關文獻流動相為甲醇--水（含1%甲酸+0.3%三乙胺）。 另有相關文獻用流動相為甲醇--水（含1%甲酸+0.3%醋酸銨）。本實驗用兩種流動相體系，樣品為溶出實驗1h取樣所制備的供試品。色譜圖如下：</p><p>　　圖1：流動相體系甲醇—水（含1%甲酸+0.3%三乙胺）（25：75）時供試品的HPLC色譜圖</p><p>　　圖2：流動相體系甲醇—水（含1%甲酸+0

62、.3醋酸銨）（25:75）時供試品的HPLC色譜圖</p><p>　　從圖1、2可以看出選擇甲醇--水（含1%甲酸+0.3%三乙胺）為流動相體系較為適宜，其中A泵為有機相甲醇，B泵為水相，進龍馬微丸溶出實驗供試品，將B泵比例調為：70%、75%、80%。水相為70%各物質沒有分開；加大水相比例為75%，同條件進標準品，士的寧、馬錢子堿的保留時間分別為10.3min、12.6min，馬、士分離較好。再加大水相為8

63、0%，士的寧保留時間較長為16.6min，馬錢子堿20min內未出峰。</p><p>　　綜上所述，后續(xù)實驗選擇流動相為甲醇-水（含1%甲酸+0.3%三乙胺）（25:75）為宜。</p><p>　　2.2.2 指標物質選擇</p><p>　　馬錢子檢測的指標物質通常為士的寧和馬錢子堿，本實驗的流動相體系甲醇-水（含1%甲酸+0.3%三乙胺）（25:75），25

64、4nm波長時，士的寧保留時間約10.5min,龍馬微丸溶出1h供試品士的寧有雜質干擾（如圖3），疑似是綠原酸，綠原酸的最大吸收波長為327nm（如圖4）,可認為馬錢子在自制龍馬微丸制作過程中，由于馬錢子的炮制或龍馬微丸的制備工藝的因素，使檢測時士的寧被綠原酸干擾。馬錢子堿保留時間為12.1min,無明顯雜質干擾，分離度較好，故選馬錢子堿做為指標物質，對龍馬微丸溶出做定量分析。</p><p>　　圖3：龍馬微丸1

65、h取樣制備供試品264nm波長處色譜圖</p><p>　　圖4：龍馬微丸1h取樣制備供試品327nm波長處色譜圖</p><p>　　2.2.3標準曲線的繪制</p><p>　　本實驗使用的馬錢子堿標準品為中國食品檢測研究院提供的國家藥品標準物質，含量為91.7%。取10.8mg,配成99.036µg/ml，取4ml99.036µg/ml溶液

66、稀釋成25ml，以此15.8458µg/ml溶液為母液，按下表稀釋：</p><p>　　表1 ：母液標準品溶液的稀釋</p><p>　　將標準品依次進樣，264nm波長下保留時間12.9min處，計算馬錢子堿的峰面積。如下表：</p><p>　　表2：不同濃度馬錢子堿標準品峰面積</p><p>　　按表2所得實驗結果，濃度為

67、橫坐標，以峰面積為縱坐標作圖，得馬錢子堿的標準曲線圖：</p><p>　　圖5：馬錢子堿的標準曲線圖</p><p>　　從馬錢子堿的標準曲線可以看出:峰面積y與供試品濃度x的關系為y=87334x，且R=0.9999說明在溶出條件下的濃度范圍內馬錢子堿的線性關系良好。</p><p>　　2.2.4去蛋白方法</p><p>　　龍馬微丸

68、制備使用原藥材為馬錢子和地龍，地龍的主要成分是蛋白質，為了防止溶出時，地龍里的蛋白溶出損害HPLC的色譜柱，對溶出實驗每個時間點所取的樣品要進行去蛋白處理，參考相關文獻，能與水混溶的有機溶劑如甲醇、乙腈、丙酮等，當它們過量存在時，可使蛋白質沉淀。通常用1～3倍體積的有機溶劑時可使90％以上的蛋白質沉淀。本實驗將所取溶出樣品加一倍乙腈去蛋白，結果發(fā)現(xiàn)在供試品濃度范圍內，一倍乙腈影響士的寧、馬錢子堿的峰形（如圖7），改用甲醇去蛋白。在相同色

69、譜條件下士的寧、馬錢子堿混合標準品的色譜圖如圖6。</p><p>　　對比圖6、7、8,本實驗選擇甲醇對溶出實驗樣品進行去蛋白處理。</p><p>　　圖6：馬、士標準品的HPLC的色譜圖</p><p>　　圖7： 馬、士標準品加乙腈稀釋一倍的HPLC色譜圖</p><p>　　圖8： 馬、士:標準品加甲醇稀釋一倍的HPLC色譜圖<

70、;/p><p>　　2.1.5 地龍粉陰性對照實驗</p><p>　　取制備龍馬微丸的原料藥材地龍粉約0.625g做溶出實驗，溶出條件：漿法，蒸餾水做溶出介質，37℃水浴，轉速100r/min。分別在5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120min取10次溶出液2ml于5mlEP管中，往溶出杯里補2ml溶出介質，EP管中加2ml甲醇，渦旋混合儀上混勻冰箱中冷置2h左右，用注

71、射器、過濾頭按濃度由低到高過濾于HPLC進樣瓶中。檢測結果入下圖9，可以看出在254nm檢測波長處地龍對馬錢子堿的檢測不會造成干擾。</p><p>　　圖9：地龍粉溶出實驗1h取樣制備供試品254nm波長處色譜圖</p><p>　　2.1.6精密度及溶液穩(wěn)定性試驗</p><p>　　課題組的往屆同學對本實驗所用的色譜柱、流動相體系，關于士的寧、馬錢子堿的檢測分

72、析做過系統(tǒng)方法學驗證，這里不再做重復試驗。根據(jù)相關方法學實驗報告，精密度試驗為馬錢子的提取液制備的供試品溶液，連續(xù)進樣六次，記錄馬錢子堿峰面積，計算峰面積RSD=0.444%，說明儀器精密度良好。</p><p>　　溶液穩(wěn)定性試驗為取馬錢子提取液制備的供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h進樣測定，記錄馬錢子堿峰面積，計算峰面積RSD=0.254%，表明供試品溶液在室溫條件下放置24 h穩(wěn)定性良好。&

73、lt;/p><p>　　2.2龍馬微丸的含量測定</p><p><b>　　2.2.1提取方法</b></p><p>　　取龍馬微丸用干燥研缽研成粉末精密稱取2.5280g，加入100ml溶液（蒸餾水：甲醇：甲酸=50:50:1），超聲30min，抽濾取濾液；用移液管移取5ml濾液于50ml容量瓶中（蒸餾水：甲醇：甲酸=50:50:1）溶液定容

74、；注射器取稀釋后的濾液加過濾頭過濾于HPLC進樣瓶中。HPLC測其濃度。</p><p><b>　　2.2.2含量計算</b></p><p>　　接收提取濾液的具塞錐形瓶中M=67.4788g,倒入濾液錐形瓶總重M=148.3126g,取5ml后錐形瓶重M=143.5583g，設稀釋后的供試品HPLC所測的濃度為x g/ml,則龍馬微丸中馬錢子堿的含量y為<

75、/p><p><b>　　y=**100%</b></p><p>　　HPLC測得x=6.8039µg/ml，將數(shù)值代入公式得龍馬微丸中馬錢子堿的含量y=0.2288%。</p><p>　　2.3龍馬微丸溶出實驗</p><p>　　取龍馬微丸（馬錢子：地龍：微晶纖維素=1:1:2）約2.5g，用溶出儀采用轉籃

76、法，900ml蒸餾水為溶出介質，水浴37℃，轉速100r/min，做A、B兩組平行試驗，兩組龍馬微丸重量為：A組2.5021g、B組2.5003g。分別在5,10,15,20,30,60,90,120,150,180min取10次溶出液2ml于5mlEP管中，往溶出杯里補2ml溶出介質，EP管中加2ml甲醇，渦旋混合儀上混勻冰箱中冷置2h左右，用注射器、過濾頭按濃度由低到高過濾于HPLC進樣瓶中。檢測結果入下表3、圖10：</p&

77、gt;<p>　　表3：不同取樣時間馬錢子堿累計溶出度</p><p>　　圖10：不同取樣時間馬錢子堿累計溶出度曲線</p><p>　　從圖9可以看出，本課題組自制龍馬微丸中馬錢子堿釋放迅速，在30min內科釋放約75%，且在90min內釋放完畢。故后續(xù)溶出實驗取樣時間到2h為止。</p><p>　　2.4中藥原材料對照實驗</p>

78、<p>　　取龍馬微丸（馬錢子：地龍：微晶纖維素=1:1:2）約2.5g，用溶出儀采用漿法，900ml蒸餾水為溶出介質，水浴37℃，轉速100r/min，用制備龍馬微丸的原藥材制馬錢子粉，制馬錢子粉并地龍粉1:1混合物做對照實驗，考察龍馬微丸原藥材制成微丸后的釋放規(guī)律變化，每組做平行實驗計算平均值，分別在5、10、15、20、30、60、90、120min取8次溶出液加一倍甲醇制備供試品溶液。其結果如表4，圖11。</

79、p><p>　　表4： 龍馬微丸與原料粉末溶出度</p><p>　　圖2.11 龍馬微丸與原料粉末溶出度曲線</p><p>　　序列1：龍馬微丸；序列2：制馬錢子粉；序列3：制馬錢子與地龍1:1混合粉</p><p>　　從圖10可以看出，同條件下的溶出性，制馬錢子粉溶出非常迅速，5min即可溶出98%，龍馬微丸有1.5h的溶出過程，且釋放完

80、畢的累計溶出度低于制馬錢子粉。并且地龍粉對制馬錢子粉中馬錢子堿的溶出無明顯的影響。</p><p>　　2.5不同溶出介質的影響</p><p>　　本次實驗各組取龍馬微丸（馬錢子：地龍：微晶纖維素=1:1:2）約2.5g，用溶出儀采用轉籃法，分別采用三種不同PH的溶出介質進行實驗，蒸餾水、PH1.2（7.65ml濃鹽酸加蒸餾水配成1000ml）、PH4.8（2.99g醋酸鈉加水溶解+14

81、ml醋酸2mol/ml溶液加水配成1000ml），900ml溶出介質，水浴37℃，轉速100r/min，分別在5,10,15,20,30,60,90,120min取8次溶出液加一倍甲醇制備供試品溶液。每組做平行試驗取平均值，其結果如表5，圖12.</p><p>　　表5：不同PH溶出介質馬錢子堿累計溶出度</p><p>　　圖12：不同PH溶出介質馬錢子堿累計溶出度曲線</p&g

82、t;<p>　　序列1：蒸餾水；序列2：PH1.2；序列3：PH4.8</p><p>　　從圖2.12可以看出酸性條件有利于龍馬微丸的釋放，PH1.2時龍馬微丸中馬錢子堿釋放的速度最快，可在30min內基本釋放完畢，PH1.2是胃酸的PH,說明未經包衣的龍馬微丸可在胃環(huán)境中充分溶出。</p><p><b>　　三、結論</b></p>

83、<p>　　3.1關于分析方法的結論</p><p>　　本課題組所制備的龍馬微丸原料為中藥原材料粉末，輔料為微晶纖維素。溶出實驗可采用轉籃法或漿法，注射器取溶出液，并補足溶出介質，用甲醇對樣品做去蛋白處理制備供試品溶液。HPLC色譜條件：色譜柱Intersustain C柱（4.6 mm×250 mm,5μm），流動相體系甲醇-水（含1%甲酸+0.3%三乙胺）（25:75），馬錢子堿保留時間

84、為12.8min,且其出峰無干擾，選為指標物質做定量分析。馬錢子堿累計溶出度Q（%）的計算公式：</p><p>　　Q（%）=x*2*900*10/(M*0.2288%)*100</p><p>　　其中，x(µg/ml)為HPLC測得的供試品液濃度，M（g）為溶出實驗所取龍馬微丸質量。</p><p>　　3.2自制龍馬微丸溶出規(guī)律及特性的結論<

85、/p><p>　　本課題組自制龍馬微丸中馬錢子堿釋放較快，在30min內可以釋放約75%，且在90min內釋放完畢。對比制備龍馬微丸的原料---制馬錢子粉，同條件下的溶出性，制馬錢子粉溶出非常迅速，在5min即可釋放98%，龍馬微丸有1.5h的溶出過程。不同溶出介質的龍馬微丸溶出實驗結果表明，酸性條件有利于龍馬微丸的釋放，PH1.2時龍馬微丸中馬錢子堿釋放的速度最快，可在30min內基本釋放完畢。</p>

86、<p><b>　　討論</b></p><p>　　4.1關于分析方法的討論</p><p>　　在色譜柱Intersustain C柱（4.6 mm×250 mm,5μm），流動相體系甲醇-水（含1%甲酸+0.3%三乙胺）（25:75）色譜條件下，生馬錢子提取液檢測，254nm波長處綠原酸對士的寧的干擾可以忽略，本實驗龍馬微丸溶出液制備的供

87、試品中士的寧的峰前有個小峰干擾（參考2.2.2），推測士的寧是受綠原酸的干擾。原因可能是龍馬微丸處方中馬錢子的炮制引起的，本課題組馬錢子的炮制方法是：揀選飽滿完好的生馬錢子，按5:1的比例分別稱取馬錢子和綠豆放入燒杯中，加入適量自來水，在電爐上放一石棉網使加熱均勻,接通電路，加熱煮沸至大部分綠豆開裂。取出馬錢子，去皮切條，置于遠紅外恒溫干燥箱中于80℃下干燥6h。另取麻油適量，置鍋內燒熱，加入經干燥后的馬錢子條，炸至棕褐色，剔出焦黑者，

88、剩余放涼，用濾紙將馬錢子表面麻油擦拭干凈。因為炮制方法不同造成士的寧色譜峰被干擾，故此選擇馬錢子堿作為指標物質做定量分析。</p><p>　　4.2自制龍馬微丸溶出規(guī)律及特性的討論</p><p>　　龍馬微丸溶出迅速，從各組實驗結果看，龍馬微丸釋放完畢時的累計溶出度均>100%，可能是HPLC的測量誤差，也有可能是龍馬微丸含量測定沒有將龍馬微丸中馬錢子堿最大量提取出來。</

89、p><p>　　從實驗結果看制馬錢子粉及地龍粉制備成龍馬微丸之后，藥物釋放特性有所改變，對龍馬微丸進行包衣或可進一步延長藥物釋放達到緩控釋作用，有待進一步研究。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　李明輝，李鳳琴，王廣林．三波長分光光度法測定壯筋骨膠囊中的士的寧的含量[J]．時珍國藥研究，1995，6(3)；17.&l

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94、年10月1日。正文第21頁。</p><p>　　李彥超，蔡寶昌，李偉東，狄留慶.馬錢子總生物堿的測定及其提取條件的正交設計優(yōu)選[J].中藥新藥與臨床藥理,2004(1)15.</p><p>　　湯淮波，張令君,李湘玲,孫成風，馬丕江.不同溶劑提取馬錢子中士的寧與馬錢子堿的實驗研究[J].中醫(yī)藥導報,2009，15(11)122~125.</p><p>　　付麗

95、佳，王玉華。當歸補血丸中阿魏酸溶出度測定[J]。中國實驗方劑學雜志.2013,15(3)188~191.</p><p>　　姚彤煒編著。體內藥物分析[M]。浙江大學出版社。2001年01月第1版,第49頁</p><p><b>　　致謝</b></p><p>　　本研究及學位論文是在我的導師吳萍老師親切關懷和悉心指導下完成的。她嚴肅的科學

96、態(tài)度，嚴謹?shù)闹螌W精神，精益求精的工作作風，深深地感染和激勵著我。在本論文的完成過程中，吳萍老師傾注了大量的心血，從選題到確定方案，從一個又一個實驗步驟的實施，到一遍又一遍地指出論文中的具體問題，嚴格把關，循循善誘，在此我表示衷心感謝。同時，要特別感謝吳老師在生活中給我以指導和幫助，在此謹向吳老師再次致以誠摯的謝意和崇高的敬意。</p><p>　　同時我還要感謝在我學習期間給我極大關心和支持的各位老師們，是你四年