EZH2調(diào)控BRCA1促進(jìn)上皮性卵巢癌惡性生物學(xué)進(jìn)展及上皮性卵巢癌石蠟標(biāo)本實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)最適內(nèi)參基因鑒定的研究.pdf

1、本文分三個部分進(jìn)行探討：
　　第一部分：EZH2調(diào)控BRCA1促進(jìn)上皮性卵巢癌惡性生物學(xué)進(jìn)展目的：探討在上皮性卵巢癌細(xì)胞中果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物2（EZH2）能否調(diào)控乳腺癌第一易感基因（BRCA1）的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制，明確BRCA1在EZH2介導(dǎo)的卵巢癌惡性生物學(xué)進(jìn)展中的作用，從而找到抑制腫瘤進(jìn)展的靶點(diǎn)。
　　方法：構(gòu)建兩個靶向沉默EZH2基因的短發(fā)夾RNA(shEZH2)質(zhì)粒表達(dá)載體，脂質(zhì)體法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至上皮性卵巢癌

2、細(xì)胞A2780，瞬時轉(zhuǎn)染至ES2和SKOV3細(xì)胞。實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)、免疫印跡和細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測下調(diào)EZH2后BRCA1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)及細(xì)胞核內(nèi)外分布情況。胰島素樣生長因子1（IGF-1）處理細(xì)胞活化AKT1，細(xì)胞免疫化學(xué)法再次檢測EZH2和BRCA1的表達(dá)及核內(nèi)外分布情況。化學(xué)合成三個靶向沉默BRCA1的小干擾RNA（siRNA），檢驗(yàn)干擾效率后，脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染至轉(zhuǎn)染了shEZH2和空白對照組細(xì)胞中，MTT

3、、Transwell小室法和流式細(xì)胞儀分別檢測下調(diào)BRCA1表達(dá)對EZH2沉默所引起的卵巢癌增殖、遷移和細(xì)胞周期改變的影響。在順鉑耐藥細(xì)胞中聯(lián)合或單獨(dú)沉默EZH2和BRCA1的表達(dá)，MTT法檢測各組細(xì)胞對順鉑敏感性的變化。
　　結(jié)果：1、上皮性卵巢癌細(xì)胞A2780、ES2和SKOV3中成功抑制EZH2表達(dá)后，BRCA1在mRNA水平上表達(dá)較對照組下調(diào)，而在蛋白水平上明顯升高，并且存在由胞漿向胞核轉(zhuǎn)移的趨勢。
　　2、在轉(zhuǎn)染s

4、hEZH2的A2780細(xì)胞中成功激活A(yù)KT1表達(dá)阻斷了BRCA1蛋白的胞漿胞核轉(zhuǎn)移效應(yīng)。
　　3、沉默EZH2的A2780和ES2細(xì)胞中聯(lián)合敲出BRCA1基因后，細(xì)胞的增殖遷移能力較未聯(lián)合敲出BRCA1基因組增強(qiáng)。
　　4、卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞A2780/DDP中聯(lián)合沉默EZH2與BRCA1表達(dá)未能疊加單獨(dú)沉默二者產(chǎn)生的細(xì)胞順鉑增敏作用。
　　結(jié)論：上皮性卵巢癌細(xì)胞中EZH2能調(diào)控BRCA1的表達(dá)及胞漿/胞核轉(zhuǎn)移，該調(diào)控

5、能被活化的AKT1所阻斷。BRCA1下調(diào)能部分逆轉(zhuǎn)EZH2引起的卵巢癌惡性生物學(xué)行為，提示BRCA1在EZH2發(fā)揮原癌基因的作用中起重要作用。
　　第二部分：上皮性卵巢癌石蠟標(biāo)本實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)最適內(nèi)參基因的鑒定目的：篩選上皮性卵巢癌石蠟標(biāo)本實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)最適內(nèi)參基因。
　　方法：以real-time PCR和ovarian cancer兩個關(guān)鍵詞在Pubmed查得2010年1月到2013年3月共計(jì)128篇全文獲取

6、十二個常用的管家基因（ACTB,GAPDH,18S rRNA,GUSB,PPIA, PBGD,PUM1,TBP,HRPT1,RPLP0,RPL13A和B2M），收集上皮性卵巢組織標(biāo)本（正常、良性、交界性和惡性）共計(jì)五十例，運(yùn)用激光顯微切割技術(shù)獲取同質(zhì)性上皮性卵巢組織用于后續(xù)研究。實(shí)時定量PCR所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用單因素方差分析或非參檢驗(yàn)進(jìn)行分析。NormFinder和geNorm兩個軟件進(jìn)一步用于驗(yàn)證候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性和實(shí)用性。
　　

7、結(jié)果：上皮細(xì)胞在正常卵巢組織中占很小比例。候選內(nèi)參基因中ACTB,PPIA,RPL13A,RPLP0和TBP不受疾病進(jìn)展影響而在正常、良性、交界性和惡性上皮標(biāo)本中相對穩(wěn)定表達(dá)，其中NormFinder和geNorm驗(yàn)證得出ACTB,PPIA,RPLP0和TBP的穩(wěn)定組合，而最常用內(nèi)參基因GAPDH在卵巢上皮細(xì)胞中的表達(dá)不穩(wěn)定，在癌組織中的表達(dá)顯著高于其他三類組織。
　　結(jié)論：在上皮性卵巢腫瘤研究中推薦同質(zhì)性上皮組織的使用和實(shí)時定量