亞洲型豬囊尾蚴3個(gè)低分子量抗原基因的克隆、表達(dá)及ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬囊尾蚴病是一種重要的人畜共患寄生蟲(chóng)病,不僅引起豬肉品質(zhì)下降,而且給人類健康造成重大危害。目前,低分子量抗原在豬囊尾蚴病的免疫診斷和免疫預(yù)防中的作用日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。本研究通過(guò)基因工程方法克隆了豬囊尾蚴8kDa抗原家族三個(gè)基因,并分別構(gòu)建重組表達(dá)載體,進(jìn)行高效表達(dá)；利用GST親和層析方法分別純化三種重組蛋白:并比較三種重組蛋白抗原性,選出抗原性最好者建立間接ELISA方法來(lái)檢測(cè)豬囊尾蚴病抗體。為豬囊尾蚴病檢測(cè)試紙條、試劑盒的研制

2、提供重要參考依據(jù)。
　　 l、利用總RNA提取技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄技術(shù)和PCR技術(shù)獲得了豬囊尾蚴8KDa家族的排泄分泌抗原M13h基因、Ts8B2基因、小扁豆凝集素抗原TsRS1基因,長(zhǎng)度分別為258bp、270bp和321bp,分別克隆入pMD19-T并測(cè)序。
　　 2、將測(cè)序正確的三種基因成熟肽部分分別亞克隆入原核表達(dá)載體pGEX-6p-1中,構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-6p-1/TsRS1、pGEX-6p-1/Ts882、p

3、GEX-6p-1/M13h；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定及測(cè)序分析,證明該基因正確插入到表達(dá)載體中,且閱讀框正確。將三種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌中進(jìn)行原核表達(dá),利用SDS-PAGE和Westem blot檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果表明:成功構(gòu)建了三種表達(dá)載體,并在大腸桿菌中高效表達(dá)了三種蛋白；經(jīng)Western blot證明三種表達(dá)蛋白均可被兔抗豬囊尾蚴囊液多抗血清特異性識(shí)別,均可作為診斷抗原。
　　 3、誘導(dǎo)表達(dá)菌體超聲波裂解

4、后,SDS-PAGE顯示三種蛋白均為可溶性表達(dá)；通過(guò)GST層析柱對(duì)三種蛋白進(jìn)行純化,同時(shí)純化空標(biāo)簽蛋白作為對(duì)照。用純化的表達(dá)蛋白和GST分別作為包被抗原包被酶標(biāo)板,排除GST。蛋白的反應(yīng)性,并比較三種重組蛋白的抗原性,選出抗原性最好的重組蛋白用于建立快速檢測(cè)豬囊尾蚴病的間接EIJSA方法。
　　 4、根據(jù)篩選結(jié)果,用純化的表達(dá)蛋白M13h作為包被抗原包被酶標(biāo)板,初步建立了快速檢測(cè)豬囊尾蚴病的間接ELISA方法?？乖粷舛葹?μ