聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)宮頸癌Hela細(xì)胞放射敏感性的體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 實(shí)驗(yàn)研究凋亡抑制基因bcl-2反義寡核苷酸(ASODN)分別與癌基因c-mycASODN及促凋亡基因bax雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染對(duì)放療誘導(dǎo)體外宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響，以及bcl-2 ASODN與bax聯(lián)合轉(zhuǎn)染對(duì)宮頸癌裸鼠皮下移植瘤生長及放療作用的影響，從而探討聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的放射增敏作用。 方法： 1.合成bcl-2 ASODN及c-myc ASODN并經(jīng)陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)行單基因及雙基因轉(zhuǎn)

2、染Hela細(xì)胞。將Hela細(xì)胞按轉(zhuǎn)染bcl-2 ASODN、 c-myc ASODN、(bcl-2+c-myc) ASODN 和對(duì)照組以及是否放射干預(yù)分為8組。通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT法、流式細(xì)胞儀等方法檢測細(xì)胞增殖與凋亡，通過免疫組化及流式細(xì)胞儀等檢測基因表達(dá)情況。 2.構(gòu)建bax基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLXSN-bax，在陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)下，將pLXSN-bax及bcl-2 ASODN分別行單基因及雙基因轉(zhuǎn)染至He

3、la細(xì)胞。將Hela細(xì)胞按轉(zhuǎn)染bcl-2 ASODN、bax、bcl-2 ASODN+bax和對(duì)照組以及是否放射干預(yù)分為8組。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、MTT法、流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞增殖與凋亡，并通過RT-PCR檢測bcl-2及bax基因表達(dá)情況。 3.建立BALB/C裸鼠宮頸癌移植瘤模型，隨機(jī)分成bcl-2 ASODN、bax、bcl-2ASODN+bax、bcl-2 SODN和對(duì)照組。移植成瘤后，開始基因轉(zhuǎn)染，并定期測量腫瘤體積，計(jì)

4、算抑瘤率。成瘤后21天給予6MV-X單次放療，并采用缺口末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL 法)檢測移植瘤的細(xì)胞凋亡。 結(jié)果： 1.(1)：平板克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，Hela細(xì)胞經(jīng)bcl-2 ASODN、c-myc ASODN單基因及雙基因轉(zhuǎn)染組并放療后較對(duì)照組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(2)：流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率：(bcl-2+c-myc)ASODN聯(lián)合轉(zhuǎn)染、bcl-2 ASODN及c

5、.myc ASODN單基因轉(zhuǎn)染并放療組的凋亡率分別為(11.83±0.57)％、(6.60±0.70)％、(10.29±0.66)％，均明顯高于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(3)：MTT法分析放射增敏比：bcl-2 ASODN、c-myc ASODN、(bcl-2+c-myc)ASODN分別為1.20、1.53和2.18(以10％細(xì)胞存活為標(biāo)準(zhǔn))；(4)：免疫組化及流式細(xì)胞儀等方法顯示各轉(zhuǎn)染組bcl-2及c-myc的表達(dá)均明

6、顯低于對(duì)照組。 2.(1)從Hela細(xì)胞cDNA中克隆到野生型的Bax-α基因序列，將Bax-α基因定向克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pLXSN中；(2)：Hela細(xì)胞經(jīng)bcl-2 ASODN+bax聯(lián)合轉(zhuǎn)染并放療后，光鏡觀察有明顯的凋亡趨勢；(3)：MTT法檢測增殖抑制率：bcl-2ASODN+bax聯(lián)合轉(zhuǎn)染并放療組細(xì)胞增殖抑制率為(63.4±4.6)％，而bax及bcl-2ASODN單基因轉(zhuǎn)染并放療組細(xì)胞增殖抑制率分別為(32.7

7、±1.8)％、(37.8±2.0)％。聯(lián)合轉(zhuǎn)染并放療組細(xì)胞增殖抑制率顯著高于其它組包括單基因轉(zhuǎn)染并放療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(4)：流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率：bcl-2 ASODN+bax聯(lián)合轉(zhuǎn)染未放療組細(xì)胞凋亡率為(26.13±2.50)％，bax及bcl-2 ASODN單基因轉(zhuǎn)染并放療組凋亡率分別為(33.04±2.71)％和(38.22±2.94)％；聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染并放療組細(xì)胞凋亡率為(58.16±3.91)％，與前

8、三者比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(5)：RT-PCR顯示轉(zhuǎn)染組bax基因表達(dá)增強(qiáng)，bcl-2基因表達(dá)減弱。 3.(1)：25只裸鼠皮下移植Hela細(xì)胞后2周均達(dá)成瘤標(biāo)準(zhǔn)，基因轉(zhuǎn)染17天后bcl-2 ASODN、bax及bcl-2 ASODN+bax組抑瘤率與bcl-2 SODN及對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.05)；(2)：放療后第4天，雙基因轉(zhuǎn)染組抑瘤率為40.0％，與其它組比較有顯著差異(P<0.05)；(3

9、)：TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：高倍鏡視野下雙基因轉(zhuǎn)染組凋亡陽性細(xì)胞數(shù)為40.5±4.9個(gè)，與其它組比較有顯著性差異。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了bax基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，通過反義寡核苷酸技術(shù)及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了Hela細(xì)胞bel-2與c-myc基因的降調(diào)節(jié)以及bax基因的增強(qiáng)表達(dá)； 2.在體外， (bcl-2+c-myc)ASODN雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染及單基因轉(zhuǎn)染組均較對(duì)照組顯著增加宮頸癌Hela細(xì)