微生物檢驗在兒科臨床的應用

1、細菌的耐藥性監(jiān)測,實驗中心,微生物檢驗在兒科臨床的應用,,抗菌藥物抑制細菌生長，必須具備的條件：,細菌耐藥性的概念,,,,1：按遺傳物質(zhì)分類固有耐藥獲得性耐藥2：按耐藥現(xiàn)象分類交叉耐藥多重耐藥,細菌耐藥性的分類：,細菌耐藥性的產(chǎn)生機制,,分子遺傳機制 生化機制,細菌耐藥的遺傳性變異是基因結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。結(jié)構(gòu)改變主要通過基因突變和基因的轉(zhuǎn)移與重組。,分子遺傳機制：,一、細菌的抗菌藥物作用靶位的改變二、細菌產(chǎn)生滅活酶（水解酶或

2、修飾 酶）三、藥物累計不足,生化機制：,,細菌產(chǎn)生誘導酶對抗生素的作用靶位進行化學修飾,基因突變造成靶位變異使抗菌藥物不易或不能與靶位結(jié)合,一、抗菌藥物作用靶位的改變,,產(chǎn)生耐藥,細菌的生理功能正常,,青霉素結(jié)合蛋白的改變核糖體靶位酶親和力的下降:導致細菌對氨基糖苷類、 磺胺類、紅霉素類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類抗菌藥物耐藥。Ⅱ型拓撲異構(gòu)酶或DNA解旋酶的改變:導致金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腸桿菌科

3、細菌和假單胞菌等對氟喹諾酮類抗生素耐藥。二氫葉酸代謝酶的改變：細菌改變二氫葉酸合成酶構(gòu)型，可使該酶與磺胺類抗菌藥物的親和力大為降低，導致細菌對磺胺藥耐藥。腸球菌對萬古霉素的耐藥機制：主要是其作用靶位，細胞壁五肽末端的D-丙氨酰- D-丙氨酸突變?yōu)镈-丙氨酰-D乳酸或D-丙氨酸而導致耐藥。,PBP： 是β－內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶位蛋白 具有轉(zhuǎn)肽酶或羧肽酶活性 位于細胞膜上，參

4、與細胞壁合成 在正常情況下：β－內(nèi)酰胺類抗生素與PBP結(jié)合，可干擾細菌肽聚糖的正常合成。在異常情況下：當某些細菌獲得外源性DNA時，編碼產(chǎn)生新的低親和力的PBP或PBP本身發(fā)生修飾改變，對抗菌藥物親和力降低，從而導致該細菌對β－內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥。 如：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌: （MRSA） 產(chǎn)生一種新的低分子量的PBP2a，當有β－內(nèi)酰胺類抗生素存在時，細菌表面5種正常的PB

5、P被抑制，不能發(fā)揮正常生理功能，而PBP2a不被抑制，可作為轉(zhuǎn)肽酶完成細胞壁的合成，使MRSA對所有β－內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥。,例如：青霉素結(jié)合蛋白（PBP)的改變,β－內(nèi)酰胺酶 氨基糖苷類鈍化酶 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 紅霉素酯化酶,二、細菌產(chǎn)生的滅活酶（水解酶或修飾酶）,,β－內(nèi)酰胺酶: 細菌產(chǎn)生的以β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物為水解產(chǎn)物的多種不同類型的降解酶，可使β－內(nèi)酰胺鍵斷裂造成β－內(nèi)酰胺類藥物失去活性。目前已知的β－內(nèi)酰胺酶

6、有200多種。β－內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物:包括青霉素與頭孢菌素類等,為臨床最常用的抗菌藥物之一。這類藥物的化學結(jié)構(gòu)中均有β－內(nèi)酰胺環(huán),可抑制細菌細胞壁的合成,此環(huán)與他們的抗菌作用密切相關(guān),當環(huán)被打開,則抗菌活性消失。,β－內(nèi)酰胺酶的分類,超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（ESBLs）主要由大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的廣譜酶TEM-1、TEM-2和SHV-1突變形成。使細菌的耐藥譜從青霉素和一、二代頭孢菌素擴大到青霉素和一、二、三代頭孢菌素及單環(huán)類，但對頭霉

7、素、碳青酶烯類及酶抑制劑敏感。AmpC酶為染色體介導的頭孢菌素酶，幾乎所有腸桿菌科細菌和銅綠假單胞菌都產(chǎn)生此酶。當此酶大量表達時，可導致細菌對除第四代頭孢菌素、碳青酶烯類之外的所有β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。且對β－內(nèi)酰胺酶抑制劑及EDTA均不敏感。金屬β－內(nèi)酰胺酶是一群能水解碳青酶烯類抗生素的酶，能被金屬螯合劑螯合，不被酶抑制劑抑制。到目前為止至少發(fā)現(xiàn)了28種。,藥物吸收減少,由于細胞壁的有效屏障或細胞膜通透性的改變，阻止藥物吸收，使

8、抗生素無法進入體內(nèi)發(fā)揮作用,主動外排泵作用,在某些細菌外膜上存在特殊的能量依賴性的藥物泵系統(tǒng)，能將進入菌體內(nèi)的藥物不斷泵出，使菌體內(nèi)的藥物濃度不足以發(fā)揮抗菌作用而導致耐藥,三、藥物累計不足,臨床常見細菌對常見抗菌藥物的主要耐藥機制,藥敏試驗的目的,細菌耐藥性監(jiān)測,以臨床細菌標本的藥敏試驗為基礎，分析所在醫(yī)院或地區(qū)常見病原菌耐藥性的變遷。,2008年我院細菌耐藥性監(jiān)測,2008年7-9月G-桿菌耐藥率,2008年抗生素使用排名,200

9、8年1-6月G+球菌耐藥率,2008年1-6月G-桿菌耐藥率,2008年10-12月細菌耐藥性監(jiān)測,注： 超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（ESBLs）檢測19株G－腸桿菌，14株陽性，陽性率為73.7％。,培養(yǎng)出的細菌種類,特殊細菌的耐藥菌株檢測試驗,1. 耐甲氧西林葡萄球菌檢測(MRSA),由染色體mecA基因介導產(chǎn)生對苯唑青霉素等β－內(nèi)酰胺類抗生素親和力很低的青霉素結(jié)合蛋白（PBP2a）。包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西

10、林凝固酶陰性葡萄球菌（MRCNS）。苯唑西林紙片法：MRSA≤13mm，MRCNS≤18mmMRSA陽性結(jié)果應注意：該菌對所有青霉素類、頭孢菌素類、碳青酶烯類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和含酶抑制劑的復合劑為耐藥，不論檢驗報告的結(jié)果是否敏感。,2. 超廣譜β－內(nèi)酰胺酶檢測（ESBLs）,ESBLs可與β－內(nèi)酰胺環(huán)的羧基共價結(jié)合，使其酰胺鍵水解。主要由大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的廣譜酶TEM-1、TEM-2和SHV-1突變形成。使細菌的耐藥

11、譜從青霉素和一、二代頭孢菌素擴大到青霉素和一、二、三代頭孢菌素及單環(huán)類，但對頭霉素、碳青酶烯類及酶抑制劑敏感。采用雙紙片擴散法，即頭孢他啶與頭孢他啶/棒酸，頭孢噻肟與頭孢噻肟/棒酸組合，任何一組藥物的抑菌直徑之差≥5mm時判斷ESBLs陽性。,3. AmpC酶的檢測,AmpC酶為染色體介導的頭孢菌素酶，優(yōu)先作用底物是頭孢菌素。幾乎所有腸桿菌科細菌和銅綠假單胞菌都產(chǎn)生此酶。當此酶大量表達時，可導致細菌對除第四代頭孢菌素、碳青酶烯類之外

12、的所有β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥。且對β－內(nèi)酰胺酶抑制劑及EDTA均不敏感。5種紙片初篩試驗：頭孢他啶、頭孢他啶/棒酸、頭孢西丁、亞胺培南和頭孢吡肟，前三種耐藥，后兩種敏感。,4. 耐萬古霉素腸球菌檢測（VRE）：,耐萬古霉素腸球菌（VRE）可分為VanA、VanB、VanC三種類型。由于MRSA增加，萬古霉素使用大幅上升，導致臨床VRE感染病人增加；VRE治療比較困難，沒有特定規(guī)律；可供選擇的有四環(huán)素、氯霉素、喹諾酮類，泌尿系可考

13、慮呋喃妥因或磺胺類。,微生物檢驗在兒科臨床的應用,溝 通 理 解 合 作,血培養(yǎng)標本的采集和運送,1. 血培養(yǎng)的數(shù)量研究結(jié)果一套血培養(yǎng)的陽性率為65％二套血培養(yǎng)的陽性率為80％三套血培養(yǎng)的陽性率為96％CLSI建議方針對于每位需要血培養(yǎng)的患者需采取2至3套。對于成年患者的血培養(yǎng)，只采單一的血培養(yǎng)是不允許的。因為單一血培養(yǎng)的結(jié)果的臨床意義很難解釋。采血培養(yǎng)后的2至5天內(nèi)，不需要重復采血培養(yǎng)，因為治療后的2至

14、5天內(nèi)血液中的感染細菌不會馬上消失。,,2. 血培養(yǎng)的采血量和時間對于成年患者，每套血培養(yǎng)瓶推薦的采血量為１0至２0ml對于嬰幼兒患者，采血量不超過患者總血量的1％（≤ 1kg采血2ml;1.1-2kg采血2ml；2.1-12.7kg采血4ml;，12.8-36.3kg采血10ml）采血盡量在寒戰(zhàn)或發(fā)熱后及未使用抗生素之前完成。在評估可疑新生兒敗血癥時，除發(fā)熱或低燒外，很少培養(yǎng)出細菌的，應該補充尿液和腦脊液培養(yǎng)。,,3. 標本的運

15、送血培養(yǎng)瓶在采血接種后必須馬上送檢血培養(yǎng)瓶在采血接種后在室溫中不得超過數(shù)小時血培養(yǎng)瓶不得在采血接種后放入冰箱或冷凍,,4. 培養(yǎng)時間與陽性率 BACTEC 9240 需氧瓶中5天的培養(yǎng)結(jié)果 ?孵育5天后共檢出1133株有臨床意義的菌株 –907株(80.0%) 在24小時內(nèi)檢出 –162株(14.3%) 在24-48 小時檢出 –18株在96小時以

16、后檢出 ?在第5天檢出的細菌 S. aureus 4 E. faecalis 1 Klebsiella spp. 5 Serratia spp. 1 Brucella spp. 2 Candida spp. 3 C. neofo

17、rmans 1,痰標本的采集和運送,小兒取痰方法 用壓舌板向后壓舌，用棉拭子伸入咽部，小兒經(jīng)壓舌刺激咳嗽時，可噴出肺部或氣管分泌物粘在拭子上，取后立即送檢。,痰標本的檢驗與臨床,痰中可分離到的三大類呼吸道感染的病原菌結(jié)核桿菌、白喉棒狀桿菌、百日咳桿菌——公認的病原菌肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡它布拉漢菌——逐漸被認識的CAP病原菌腸桿菌科細菌、非發(fā)酵菌、葡萄球菌等——條件致病菌,,痰中檢出結(jié)核桿菌,白喉棒

18、狀桿菌, 百日咳桿菌屬于確診報告痰中培養(yǎng)出肺炎鏈球菌,流感嗜血桿菌,卡他布拉漢氏菌基本上可以確診為社區(qū)獲得性肺炎的病原菌.除此以外的其他革蘭陰性桿菌,革蘭陽性球菌,真菌屬參考報告.參考的價值約30%.,,目前，痰中分離出的細菌種類大致排位是：綠膿桿菌，不動桿菌，肺炎克雷伯菌，陰溝腸桿菌，變形桿菌，大腸桿菌，某些少見的腸桿菌科細菌及非發(fā)酵菌，葡萄球菌，念珠菌，糞腸球菌,肺炎鏈球菌,流感嗜血桿菌…. 幾乎全部是條件

19、致病菌,,條件致病菌的幾種身份病原菌：患者由這類菌引起感染，用細菌報告提示的抗生素治療，療效明顯定植菌： ①用細菌報告提示的抗生素治療，該菌消失，感染癥狀依然存在 ②或是由于該菌泛耐藥，臨床憑經(jīng)驗聯(lián)合用藥，感染癥狀好轉(zhuǎn)，但該菌依然存在 上述兩種現(xiàn)象說明，細菌報告中的病原菌與感染毫無關(guān)系污染菌：留取標本過程中，污染了非感染部位的細菌,某種情況：,患者的感染已基本治愈，做痰檢的目的是希望得到一張陰性報告做為

20、停止治療,出院的憑證。培養(yǎng)：生長大量陰性桿菌，較常見的是綠膿桿菌和不動桿菌 患者已接受了較長時間的抗生素治療，在清除了病原菌的同時，上呼吸道的正常菌同時被殺傷，定植抗力削弱，醫(yī)院中常見的綠膿桿菌，不動桿菌由于耐藥性極強，有機會在上呼吸道大量生長。這類細菌致病力較弱，與宿主形成和平共處的狀態(tài)，這是典型的定植現(xiàn)象。清除這些不應在呼吸道大量生長的定植菌最佳的手段是停用抗生素，讓呼吸道正常菌群重新生長，拮抗定植菌。,糞便標本的采集和運送

21、,自然排便法：自然排便后，挑取有膿血、黏液部位的糞便2－3克，液狀糞便取絮狀物盛于無菌的容器內(nèi)送檢。直腸拭子方法：如不易獲得糞便時或排便困難的患者及幼兒，可采取直腸拭子方法采集，取出后插入滅菌試管內(nèi)送檢。 以肥皂，水和70﹪的酒精，將肛門周圍洗凈，然后用一根浸過無菌生理鹽水的棉拭子，插入肛門約５mm處，輕輕旋轉(zhuǎn)，使之與直腸黏膜表面接觸，然后取出置于無菌試管中立刻送至微生物室．,糞便標本的檢驗和臨床,糞便檢驗主要是患

22、者出現(xiàn)腹瀉癥狀，而引起腹瀉的原因主要有： 1.細菌感染 2.食物中毒 3.菌群失調(diào)患者吃了不清潔的食物，出現(xiàn)腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等癥狀前來就醫(yī)醫(yī)生根據(jù)患者主述，大便常規(guī)檢驗,診斷為菌痢或腸炎治療：靜脈補液加抗生素這種有效的治療方法至今還在延用,但下述情況，此方法無效：,住院長期使用抗生素的患者，出現(xiàn)腹瀉癥狀（每日次數(shù)增多，大便呈糊狀），腹部不適，食欲欠佳。 其本質(zhì)原因是治療其他感染性疾病所使用

23、的抗生素在發(fā)揮治療作用的同時傷及腸道正常菌群，數(shù)量上占優(yōu)的原籍菌被殺滅或抑制，而某些耐藥的少數(shù)菌乘機大量繁殖，引起腸道生態(tài)失調(diào)。,,腸道生理菌群的主要種類及分布緊貼腸黏膜：以雙岐桿菌、乳酸桿菌為主中間層：類桿菌、真桿菌、消化球菌和消化鏈球菌等外層：大腸桿菌、糞腸球菌為主共400余種細菌按一定數(shù)量比例、空間層次構(gòu)成一個相對穩(wěn)定的和諧微生態(tài)社會具有較強的緩沖能力，維持人體生態(tài)平衡,,抗生素相關(guān)腹瀉抗生素治療的結(jié)果：殺敵一千，自損

24、八百近期損傷：嚴重的菌群失調(diào)，生態(tài)平衡打破，超過腸道緩沖能力，腸蠕動加快，大便糊狀或稀便，腹部不適，食欲減退遠期損傷：經(jīng)抗生素殺菌后存活下來的細菌，為高度耐藥菌群,如產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌、MRSA、VRE，這些條件致病菌如若定位轉(zhuǎn)移，造成其他器官或系統(tǒng)的感染，治療將極為困難,,抗生素相關(guān)性腹瀉的實驗室診斷 抗生素相關(guān)性腹瀉的本質(zhì)是腸道菌群失調(diào) 細菌培養(yǎng)的現(xiàn)象： 1.未生長志賀氏菌、沙門氏菌

25、 2.未生長真菌 3.未生長或生長少量大腸桿菌 4.生長其它陰性桿菌或陽性球菌 這種現(xiàn)象就是腸道菌群失調(diào),,腸道菌群失調(diào)的分類I度失調(diào)：無癥狀或癥狀輕微，停藥后自行恢復，無須治療II度失調(diào)：患者腹部不適，食欲不佳；大便糊狀或稀便，次數(shù)明顯增加；為醫(yī)院最常見的菌群失調(diào)類型，與I度區(qū)別是停藥后無法自行恢復； 治 療：“先抑后補” ，用敏感抗生素殺滅不該大量生長的細菌,使其數(shù)量降至原有狀態(tài),

26、2-3天后停藥，給予生態(tài)制劑補充生理菌群（如雙岐桿菌等）III度失調(diào)：血水樣便，次數(shù)多達每天十次以上,；又稱菌群交替癥，病原菌最為常見的是難辨梭狀芽孢桿菌，其可產(chǎn)生大量腸毒素；糞便中有肉眼可見膜狀物（壞死腸黏膜脫落） 治 療：首選萬古霉素，次選滅滴靈.,,尋找新生兒腹瀉的原因一個三個月大的嬰兒因持續(xù)腹瀉做大便常規(guī)及培養(yǎng) 常規(guī)結(jié)果:黃色糊狀便 鏡檢未見異常 培養(yǎng)結(jié)果: 純生長大量肺炎克雷伯菌.

27、 即不是病原菌也不是正常菌.,,可能的原因胃腸道功能不健全飲食及用品不清潔消化不良因發(fā)熱或感染使用了抗生素受涼以上5種原因詢問后均被排除新生兒腹瀉的真正原因是: 吃的母乳中含大量抗生素,,對于順產(chǎn)產(chǎn)婦，無須使用抗生素，及早母乳喂養(yǎng)對于嬰兒的生長發(fā)育、認知發(fā)育以及預防一些影響健康的疾病無疑是有益的。然而對于產(chǎn)道受損及剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦，臨床為預防或治療感染，抗生素使用是必然的，藥物吸收之后極易擴散至乳汁中，