微生物檢測(cè)簡(jiǎn)介

1、食品微生物檢驗(yàn),2016.2.16,一、微生物檢測(cè)工作的意義,據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，在全世界每年數(shù)以億計(jì)的食源性疾病患者中，70％是由于食用了各種致病性微生物污染的食品和飲水造成的。2000年至2002年，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所對(duì)全國(guó)部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、水產(chǎn)品、蔬菜中的致病菌污染狀況的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，微生物性食物中毒仍居首位，占39.62％；化學(xué)性食物中毒占38.56％；動(dòng)植物性和原因不明的食物中毒均占10％左右

2、。,傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法，主要包括形態(tài)檢查和生化方法，涉及的實(shí)驗(yàn)較多、操作繁瑣、需要時(shí)間較長(zhǎng)、準(zhǔn)備和收尾工作繁多。1955年德國(guó)學(xué)者F.J.Forg 發(fā)明了一種簡(jiǎn)單快速的大腸菌群快速檢測(cè)法—紙片法，使原來(lái)的檢測(cè)周期由72小時(shí)縮短到15小時(shí)，材料成本降低了四分之三，同時(shí)大大簡(jiǎn)化了操作程序。從此，這種生化檢測(cè)方法開(kāi)始發(fā)展起來(lái)。另外，將培養(yǎng)基固化在試劑盒中的速測(cè)盒法，也是一種較為簡(jiǎn)潔快速的檢測(cè)方法，省去了大量的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作。,二、開(kāi)展微生

3、物檢測(cè)所需的基本條件,無(wú)菌室（含紫外燈等消毒設(shè)備的隔離空間）；恒溫培養(yǎng)箱；微生物檢測(cè)設(shè)備、器皿、試劑等；高壓滅菌鍋；（滅菌是否徹底）具備以上設(shè)備和無(wú)菌操作概念即可進(jìn)行檢測(cè)了。,滅菌徹底與否指示,滅菌指示膠帶（3M）生物指示（嗜熱脂肪芽孢桿菌 121.1℃）,,紫外燈相關(guān),強(qiáng)度：對(duì)室內(nèi)空氣的消毒，直接照射法：采用室內(nèi)懸吊式紫外線消毒時(shí)，室內(nèi)安裝紫外線消毒燈（30Ｗ紫外燈，在1.0m 處的強(qiáng)度 >70μW/cm2）的數(shù)量為平

4、均每立方米不少于 1.5W，照射時(shí)間不少于30min。更換頻率：紫外線燈使用過(guò)程中其輻照強(qiáng)度逐漸降低，故應(yīng)定期測(cè)定消毒紫外線的強(qiáng)度，一旦降到要求的強(qiáng)度以下時(shí)，應(yīng)及時(shí)更換。 紫外線消毒燈的使用壽命，即由新燈的強(qiáng)度降低到70μW/cm2 的時(shí)間(功率≥30W)，或降低到原來(lái)新燈強(qiáng)度的 70%（功率 <30Ｗ）的時(shí)間，應(yīng)不低于 1000h。紫外線燈管有高硼玻璃和石英玻璃之分，由于高硼玻璃的UV254nm紫外線透過(guò)率只有50%左右，一

5、般只有1000小時(shí)；石英是紫外線透過(guò)率最高的材料，普通石英可以透過(guò)UV254的80%以上，石英玻璃紫外線燈壽命一般大于6000小時(shí)，進(jìn)口的紫外線燈可以到8000h以上，部分廠家可以達(dá)到1200小時(shí)。 紫外線強(qiáng)度計(jì)至少1年標(biāo)定1次 。,紫外線輻照時(shí)間計(jì)算,照射劑量和時(shí)間：不同種類的微生物對(duì)紫外線的敏感性不同，用紫外線消毒時(shí)必須使用照射劑量達(dá)到殺滅目標(biāo)微生物所需的照射劑量。殺滅一般細(xì)菌繁殖體時(shí)，應(yīng)使照射劑量達(dá)到10 000μW.s/cm

6、2；殺滅細(xì)菌芽孢時(shí)應(yīng)達(dá)到100 000μW.s/cm2；病毒對(duì)紫外線的抵抗力介于細(xì)菌繁殖體和芽胞之間；真菌孢子的抵抗力比細(xì)菌芽孢更強(qiáng)，有時(shí)需要照射到600 000μW.s/cm2，但一般致病性真菌對(duì)紫外線的抵抗力比細(xì)菌芽胞弱；在消毒的目標(biāo)微生物不詳時(shí)，照射劑量不應(yīng)低于100 000μW.s/cm2。輻照劑量是所用紫外線燈在照射物品表面處的輻照強(qiáng)度和照射時(shí)間的乘積。因此，根據(jù)紫外線光源的輻照強(qiáng)度，可以計(jì)算出需要照射的時(shí)間。例如，用輻照強(qiáng)度

7、為 70μW/cm2 的紫外線表面消毒器近距離照射物品表面，選擇的輻照劑量是 100 000μW.s/cm2，則需照射的時(shí)間是：100 000μW.s/cm2 ÷ 70μW/cm2 = 1429 s ÷ 60s ≌ 24min。,,1、概念的理解無(wú)菌是指物體中沒(méi)有活的微生物存在。防止微生物進(jìn)入人體或物體的操作方法，稱為無(wú)菌技術(shù)或無(wú)菌操作。關(guān)鍵點(diǎn)：人：操作前洗手更衣等物：試劑器械環(huán)境：無(wú)菌室,三、 無(wú)菌操

8、作和注意事項(xiàng),四、 革蘭氏染色,革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師、細(xì)菌學(xué)家 Christain Gram創(chuàng)立。步驟： a. 將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗。b. 滴加革蘭氏碘液，作用lmin，水洗。c. 滴加95%乙醇脫色約15-30s，直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗。d. 滴加復(fù)染液，復(fù)染lmin，水洗、待干、鏡檢。,原理：細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，而經(jīng)碘液媒染

9、后，用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽(yáng)性菌（G+），后者為革蘭氏陰性菌（ Gˉ ）。　G﹢菌：細(xì)胞壁厚，肽聚糖網(wǎng)狀分子形成一種透性障，當(dāng)乙醇脫色時(shí)，肽聚糖脫水而孔障縮小，故保留結(jié)晶紫-碘復(fù)合物在細(xì)胞膜上。呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，其脂含量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細(xì)胞壁，番紅染液復(fù)染后呈紅色。革蘭氏陽(yáng)性菌：葡

10、萄球菌屬（主要是金黃色葡萄球菌）、蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特氏菌等；革蘭氏陰性菌：埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬（痢疾桿菌等）、霍亂弧菌、副溶血性弧菌等。,五、BSL簡(jiǎn)介,biology security level (BSL):生物安全水平 根據(jù)所用病原微生物的危害程度、對(duì)人和動(dòng)物的易感性、氣溶膠傳播的可能性、預(yù)防和治療的可行性等因素，其實(shí)驗(yàn)室生物安全水平共分為四級(jí)，一級(jí)最低，四級(jí)最高。 　　一級(jí)生物安全水平（BSL-

11、1）：能夠安全操作，對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員和動(dòng)物無(wú)明顯致病性的，對(duì)環(huán)境危害程度微小的，特性清楚的病原微生物的生物安全水平。 　　二級(jí)生物安全水平（BSL-2）：能夠安全操作，對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員和動(dòng)物致病性低的，對(duì)環(huán)境有輕微危害的病原微生物的生物安全水平。如：大腸埃希氏菌,三級(jí)生物安全水平（BSL-3）：能夠安全地從事國(guó)內(nèi)和國(guó)外的，可能通過(guò)呼吸道感染，引起嚴(yán)重或致死性疾病的病原微生物工作的生物安全水平。如：炭疽芽孢桿菌、鼠疫桿菌、結(jié)核分枝桿菌、

12、狂犬病毒 　　四級(jí)生物安全水平（BSL-4）：能夠安全地從事國(guó)內(nèi)和國(guó)外的，能通過(guò)氣溶膠傳播，實(shí)驗(yàn)室感染高度危險(xiǎn)，嚴(yán)重危害人和動(dòng)物生命和環(huán)境的，沒(méi)有特效預(yù)防和治療方法的微生物工作的生物安全水平。與上述相近的或有抗原關(guān)系的，但尚未完全認(rèn)識(shí)的病原體也應(yīng)在此種水平條件下進(jìn)行操作，直到取得足夠的數(shù)據(jù)后，才能決定是繼續(xù)在此種安全水平下工作還是在低一級(jí)安全水平下工作。如：埃博拉病毒、馬爾堡病毒、天花病毒,六、提高檢測(cè)速度的一些方法,一、設(shè)備更新：

13、移液管、吸球/移液器普通高壓蒸汽滅菌器/全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器攪拌器或勻漿機(jī)/拍擊式均質(zhì)器,二、采用快速檢測(cè)方法進(jìn)行粗篩紙片法快速檢測(cè)試劑盒,測(cè)試片檢測(cè)結(jié)果圖像,七、常見(jiàn)微生物檢測(cè)設(shè)備,,Biolog微生物鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)容量是目前世界上最大的，可鑒定包括細(xì)菌、酵母和絲狀真菌在內(nèi)總計(jì)1973種微生物，涵蓋了所有的人類、動(dòng)物、植物病原菌以及食品和部分環(huán)境微生物，其中細(xì)菌234個(gè)屬，1 226個(gè)種。,BIOLOG全自動(dòng)快速微生物鑒定儀,原理

14、： Biolog自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)主要根據(jù)細(xì)菌等95種碳源的利用情況,配合四唑類顯色物質(zhì)進(jìn)行鑒定。,分子生物學(xué)細(xì)菌鑒定,1. 16S rRNA分析 2. 特異片段擴(kuò)增3.DNA指紋技術(shù) （RFLP－DNA的限制 性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 , RAPD-隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 ),PCR儀,BD PHOENIX SYSTEM“鳳凰”全自動(dòng)細(xì)菌/鑒定藥敏系統(tǒng),1．概況1998年Becton Dickin

15、son and Company公司Phonenix全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏系統(tǒng),原理 采用熒光增強(qiáng)原理與傳統(tǒng)酶、底物生化呈色反應(yīng)結(jié)合。（菌種庫(kù)270種細(xì)菌）,MICROSCAN微生物自動(dòng)鑒定及藥敏系統(tǒng),概況 MicroScan自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)包括半自動(dòng)系列AutoScan-4以及全自動(dòng)系列Walkaway 40/96 。是美國(guó)最普遍使用的鑒定系列之一。,原理 將熒光物質(zhì)均勻地混在培養(yǎng)基中，菌種接種到鑒定板，通過(guò)檢測(cè)熒光

16、底物的水解、底物被利用后的pH變化，特殊代謝產(chǎn)物的生成和某些代謝產(chǎn)物的生成率來(lái)進(jìn)行菌種鑒定。,原理：采用傳統(tǒng)生化反應(yīng)，8進(jìn)位數(shù)碼鑒定及熒光分析相結(jié)合。熒光分析是用熒光標(biāo)記細(xì)菌表面特異酶的底物，經(jīng)細(xì)菌水解底物產(chǎn)生熒光來(lái)判斷結(jié)果,SENSITITRE (自動(dòng)熒光法微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng) ）,AutoReader,ARIS（可以自動(dòng)孵育）,,VITEK,VITEK-ATB(半自動(dòng)微生物鑒定和藥敏系統(tǒng))Vitek-AMS（全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥