植物病原細(xì)菌研究方法

1、植物病原細(xì)菌研究方法,,植物保護(hù)學(xué)研究方法系列專題,,內(nèi)容提綱：,細(xì)菌的基本形態(tài)特征常規(guī)細(xì)菌生理生化檢測(cè)方法細(xì)菌種類(lèi)鑒定方法植物病原細(xì)菌檢測(cè)和細(xì)菌病害診斷方法有益細(xì)菌的利用研究,細(xì)菌的基本形態(tài)特征,細(xì)菌（bacteria）是單細(xì)胞原核微生物，個(gè)體微小，形態(tài)簡(jiǎn)單，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，細(xì)菌分布最廣、數(shù)量最多。,細(xì)菌的形態(tài)和大小細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)菌的繁殖與群體形態(tài),（一）細(xì)菌的大小,,細(xì)菌大小的測(cè)定：(1)測(cè)量：

2、 測(cè)微尺(2)長(zhǎng)度單位：微米(μm)(3)表示： 球菌：直徑 桿菌： 寬×長(zhǎng) 螺菌： 寬、長(zhǎng)、螺距,通常球菌直徑：0.2 — 1.5 μm， 桿菌:長(zhǎng)1— 5 μm, 寬0.5— 1 μm。例如：大腸桿菌：平均長(zhǎng)度：2 μm ； 寬度0.5μm

3、 1500個(gè)大腸桿菌頭尾相接等于3mm; 109個(gè)大腸桿菌重1 mg. 由于菌種不同，細(xì)菌的大小存在很大的差異；對(duì)于同一個(gè)菌種，細(xì)胞的大小也常隨著菌齡變化。另外，對(duì)于同一個(gè)菌種染色前后其細(xì)胞大小都有所不同。所以，有關(guān)細(xì)菌大小的記載，常是平均值或代表性數(shù)值。,,細(xì)菌細(xì)胞的大小,（二）、 細(xì)菌的形態(tài),不同細(xì)菌的形態(tài)可以說(shuō)是千差萬(wàn)別，豐富多彩，但就單個(gè)有機(jī)體而言，其基本形態(tài)可分為球狀、桿狀與螺旋狀三種.

4、除了球菌、桿菌、蛆旋菌三種基本形態(tài)外，還有許多具其他形態(tài)的細(xì)菌。例如柄桿菌細(xì)胞上有柄、菌絲、附器等細(xì)胞質(zhì)伸出物，細(xì)胞呈桿狀或梭狀，并有特征性的細(xì)柄；球衣菌能形成衣峭，桿狀的細(xì)胞呈鏈狀排列在衣鞘內(nèi)而成為絲狀,而支原體由于只有細(xì)胞膜，沒(méi)有紉胞壁，故細(xì)胞柔軟，形態(tài)多變，具有高度多形性。另外，人們還發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞呈星形和方形的細(xì)菌。,球狀、桿狀和螺旋狀,細(xì)菌的三種基本形態(tài):,,1. 球 菌,單球菌,雙球菌,鏈球菌,四聯(lián)球菌,八疊球菌,葡萄球菌,

5、2.桿菌 桿菌是細(xì)菌中種類(lèi)最多的類(lèi)型,因菌種不同,菌體細(xì)胞的長(zhǎng)短、粗細(xì)等都有所差異。 桿菌的形態(tài)：短桿狀、長(zhǎng)桿狀、棒桿狀、梭狀、梭桿狀、月亮狀、分枝狀、竹節(jié)狀等；按桿菌細(xì)胞的排列方式則有鏈狀、柵狀、“八”字狀以及有鞘衣的絲狀等。,2.桿 菌,短桿菌,長(zhǎng)桿菌,梭狀芽孢桿菌,鏈狀桿菌,單桿菌,2.桿 菌,,桿菌細(xì)胞兩端的形態(tài)特征,2.桿 菌,3、螺旋菌螺旋狀的細(xì)菌稱為螺旋菌。根據(jù)其彎曲情況分為：弧菌：螺旋不滿一圈，

6、菌體呈弧形或逗號(hào)形 例：霍亂弧菌、逗號(hào)弧菌螺旋菌：螺旋滿2—6環(huán)，螺旋狀 例：干酪螺菌 螺旋體：旋轉(zhuǎn)周數(shù)在6環(huán)以上，菌體柔軟。 例：梅毒密螺旋體,螺旋菌,弧菌,螺旋體,3、螺旋菌,細(xì)菌的特殊形態(tài)： 柄細(xì)菌、腎形菌、臂微菌、網(wǎng)格硫細(xì) 菌、貝日阿托氏菌(絲狀)、具有子實(shí)體的粘細(xì)菌、三角形、方形等特殊形態(tài)的細(xì)菌。,,細(xì)菌的特殊形態(tài),二、細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu),基本結(jié)構(gòu)包括：

7、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核區(qū)、間體、核糖體、氣泡和儲(chǔ)藏物。 特殊結(jié)構(gòu)包括：莢膜、鞭毛、纖毛、芽孢。,細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu),1.固體斜面培養(yǎng) 2. 液體培養(yǎng)基 3. 半固體培養(yǎng),植物病原細(xì)菌概述 絕大多數(shù)為好氣性細(xì)菌；生長(zhǎng)溫度大多為2

8、5-28℃，少數(shù)可以20℃或在35℃中（如青枯菌）生長(zhǎng)。 植物病原細(xì)菌都不產(chǎn)生芽孢，因此對(duì)高溫比較敏感，一般在50℃左右的熱水中處理10分鐘即失活，適宜的pH為6-7。,植物病原細(xì)菌的革蘭氏染色（細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)是細(xì)菌分類(lèi)鑒定的一個(gè)重要特征）,常規(guī)細(xì)菌生理生化檢測(cè)方法,細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu),革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁：由肽聚糖和磷壁酸組成,磷壁酸：占40%。G+菌所特有,其主鏈由數(shù)十個(gè)磷酸甘油或磷酸核糖醇組成,有的還有由D—Ala

9、和還原糖組成的側(cè)鏈。,肽聚糖:占30~70% ,不同菌種中肽聚糖(肽鏈)組分不同。,,革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁：分內(nèi)壁層和外壁層。,內(nèi)壁層：緊貼胞膜,僅由1—2層肽聚糖分子構(gòu)成,占細(xì)胞壁干重5-10%,無(wú)磷壁酸。,外壁層：位于肽聚糖層的外部。 脂多糖; 脂蛋白、 包括: 蛋白質(zhì)層: 基質(zhì)蛋白、 外壁蛋白; 磷脂.,,,,,革蘭

10、氏染色的原理,革蘭氏染色原理：第一步：結(jié)晶紫使菌體著上紫色；第二步：碘和結(jié)晶紫形成大分子復(fù)合物，分子大，能被細(xì)胞壁阻留在細(xì)胞內(nèi)；第三步：酒精脫色，細(xì)胞壁成分和構(gòu)造不同，出現(xiàn)不同的反應(yīng)；G+ 菌：細(xì)胞壁厚，肽聚糖含量高，交聯(lián)度大，當(dāng)乙醇脫色時(shí)，肽聚糖因脫水而孔徑縮小，故結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被阻留在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞不能被酒精脫色，仍呈紫色；Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，因其含脂量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫

11、-碘復(fù)合物溶出細(xì)胞壁，酒精將細(xì)胞脫色，細(xì)胞無(wú)色，沙黃復(fù)染后呈紅色。,革蘭氏染色法是細(xì)菌細(xì)胞的復(fù)合染色法，由丹麥醫(yī)生Hans Christian Gram于1884年創(chuàng)立。基本步驟： 涂片固定—— 結(jié)晶紫初染1min—— 碘液媒染1min——95%乙醇脫色0.5min—— 番紅復(fù)染min 結(jié)果: 革蘭氏陽(yáng)性菌——紫色； 革蘭氏陰性菌——紅色。,①革蘭氏染色法：,,,實(shí)驗(yàn)材料 待測(cè)細(xì)菌

12、 枯草芽孢桿菌（G+） 甘藍(lán)黑腐病菌（G-） 染液：結(jié)晶紫草酸銨染劑、魯戈?duì)柕庖?、?fù)染劑（番紅O） 用具：移植餌、清潔無(wú)脂載玻片,,,,,,,清潔無(wú)脂載玻片,,陽(yáng)性對(duì)照菌（紫色或藍(lán)黑色）,待 測(cè) 菌,陰性對(duì)照菌（紅色）,示范圖,,,,,對(duì)照菌呈現(xiàn)正確顏色，實(shí)驗(yàn)才為成功,,,,,涂片,干燥,固定,,,染色1min,水洗、吸干,鏡檢,簡(jiǎn)單染色,制備涂片標(biāo)本→染色,,,,,陽(yáng)性菌,陰性菌,①革蘭氏染

13、色法,革蘭氏染色陰性——大腸桿菌,革蘭氏染色陽(yáng)性——枯草芽孢桿菌,,,注： （1）、實(shí)驗(yàn)細(xì)菌為活躍生長(zhǎng)期的培養(yǎng)物； （2）、菌液不能太濃，涂片不宜過(guò)厚，造成假陽(yáng)性； （3）、火焰固定涂片，以載玻片不燙手為宜； （4）、脫色時(shí)間把握好，過(guò)長(zhǎng)，假陰性；過(guò)短，假陽(yáng)性。,鞭毛：某些細(xì)菌表面由細(xì)胞內(nèi)生出的細(xì)長(zhǎng)、波曲、毛發(fā)狀的結(jié)構(gòu)。鞭毛具有運(yùn)動(dòng)功能，一般認(rèn)為鞭毛靠鞭毛絲旋轉(zhuǎn)而動(dòng)，它們是細(xì)菌的“運(yùn)動(dòng)器官”。

14、鞭毛的長(zhǎng)度：一般為15—20 µm，最長(zhǎng)可達(dá)70 µm 。鞭毛的直徑：為0.01—0.02 µm. 不同細(xì)菌的鞭毛數(shù)目和著生位置不同，鞭毛數(shù)目一般一至數(shù)十條。,細(xì)菌鞭毛染色,鞭毛的著生方式：,周生,鞭毛的化學(xué)組成： 主要由鞭毛蛋白構(gòu)成，還含有少量的多糖、脂類(lèi)和核酸等。鞭毛起源于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的基粒。 細(xì)胞質(zhì)區(qū)內(nèi)有一個(gè)顆粒狀小體，此小體為基粒，鞭毛自基粒長(zhǎng)出穿過(guò)細(xì)胞壁延伸到

15、細(xì)胞外部。,鞭毛的結(jié)構(gòu)： 鞭毛絲鞭毛 鞭毛鉤 基體,,鞭毛的觀察：電鏡特殊鞭毛染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察半固體穿刺培養(yǎng)從固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)判斷一般情況下： 菌落形狀大，薄且不規(guī)則，邊緣極不平整，可能有鞭毛。菌落十分圓滑，邊緣平整且相對(duì)較厚，可能沒(méi)有鞭毛。,實(shí)驗(yàn)菌種及藥品 1．菌種：枯草芽孢桿菌 2．染液 染液A： 單寧酸

16、 5.0g 氯化鐵（Fecl36H2O） 1.5g 福爾馬林（15％） 2.0ml （15%福爾馬林：40%甲醛4ml+蒸餾水6ml） NaOH(1%) 1.0ml

17、 蒸餾水 100ml 染液B： 硝酸銀 2g 蒸餾水 100ml,,三、染色方法： 銀鹽染色法,硝酸銀溶于蒸餾水中。取10ml作回滴用，向其余90ml硝酸銀溶液中逐滴加濃氫氧化銨，先形成很濃的沉淀，再繼續(xù)滴加濃氫氧化銨至沉淀消失為止。然后慢慢滴入備用的硝酸銀溶液則

18、出現(xiàn)少量霧狀沉淀，但輕輕搖動(dòng)后，沉淀又消失，再滴入硝酸銀溶液，直到搖動(dòng)后霧狀沉淀不再消失為止。此液不耐保存，4小時(shí)內(nèi)染色效果最佳。,,,四、鞭毛染色步驟：,（1）將菌株在NA斜面上于30℃恒溫箱中培養(yǎng)17-20小時(shí)，取出，沿壁管輕輕加入3-5ml的滅菌水掩蓋斜面菌苔。斜放靜置10分鐘，使細(xì)菌自然游出，勿搖動(dòng)，備用。 （2）用移植環(huán)取菌懸液于無(wú)劃痕的無(wú)脂玻片上，傾斜玻片，使之成帶狀，將玻片在空氣中自然風(fēng)干。 （3）滴加染液A于干燥

19、的涂片上，覆蓋涂片，染色10-13分鐘，傾去染液，用蒸餾水充分洗去染液；風(fēng)干后，再滴加染液B覆蓋涂片染色30秒至1分鐘，立即用蒸餾水沖洗，放于空氣中干燥，在高倍鏡或油鏡下鏡檢。 （4）在金色背景下，細(xì)菌鞭毛深褐色到黑色，菌體淺褐色。,,,菌體,,鞭毛,,,,,菌體,,鞭毛,,,,,,菌體,,鞭毛,,芽孢 概念：某些菌生長(zhǎng)到一定階段，細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)圓形、橢圓形或卵圓形的內(nèi)生孢子，是對(duì)不良環(huán)境有較強(qiáng)抵抗力的休眠體。,芽孢,

20、能形成芽孢的細(xì)菌種類(lèi)： 在桿菌中能形成芽孢的種類(lèi)較多，在球菌和螺旋菌中只有少數(shù)菌種可形成芽孢。產(chǎn)生芽孢的幾個(gè)屬：芽孢桿菌屬梭狀芽孢桿菌屬芽孢乳桿菌屬生孢八疊球菌屬（其中的一個(gè)種）,芽孢的形態(tài)及其在細(xì)胞中的位置：,A 近中央,B 末端,C 中央,細(xì)菌芽孢的各種類(lèi)型,芽孢的組成和結(jié)構(gòu) 芽孢有多層結(jié)構(gòu)，主要包括孢外壁、芽孢衣、皮層和核心.,芽孢的結(jié)構(gòu),,,芽孢的外壁層厚而致密，主要成分為脂蛋白，通透性差,不易著色。核心含

21、有大量的DNA、RNA、蛋白質(zhì)酶等物質(zhì)，還含有2,6—吡啶二羧酸（DPA）,DPA是芽孢特有的成分。一般以 DPA—Ca的形式存在。皮層主要含芽孢肽聚糖、 DPA—Ca，皮層體積大，比較致密。芽孢平均含水量低,約40%.,芽孢的特性:具有很強(qiáng)的抗熱、抗干燥、抗輻射、抗化學(xué)藥物能力。 含水量低、壁厚而致密，通透性差,不易著色。新陳代謝幾乎停止，處于休眠狀態(tài)。一個(gè)芽孢萌發(fā)產(chǎn)生一個(gè)個(gè)體。芽孢的抗熱機(jī)制： 目前尚不清楚，但

22、可能與以下因素有關(guān)，如含水量低、壁厚而致密，芽孢中的酶分子量小，比較耐熱。,芽孢染色（孔雀綠藏紅染色） 染劑Ⅰ 孔雀綠水溶液 5％ 染劑Ⅱ 藏紅水溶液 0.5％ 或 堿性品紅水溶液 0.05％染色方法： 1、涂片固定； 2、加染劑Ⅰ在酒精燈火焰上加熱染色1min，勿使染液沸騰和干燥； 3、水洗； 4、染劑Ⅱ

23、染色15s； 5、水洗，風(fēng)干后鏡檢。菌體染成紅色，芽孢染成綠色。,芽孢,菌體,,常規(guī)鑒定方法全自動(dòng)微生物鑒定儀--Biolog,植物病原細(xì)菌的鑒定方法,菌落特征比較,常規(guī)細(xì)菌鑒定方法,參考：東秀珠等，常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)，科學(xué)出版社，2001,全自動(dòng)微生物鑒定儀--Biolog,鑒定原理 Biolog公司獨(dú)創(chuàng)的碳源利用方法，利用微生物對(duì)不同碳源代謝率的差異，針對(duì)每一類(lèi)微生物篩選95種不同碳源，配合四唑類(lèi)

24、顯色物質(zhì)（如TTC、TV），固定于96孔板上（A1孔為陰性對(duì)照），接種菌懸液后培養(yǎng)一定時(shí)間，通過(guò)檢測(cè)微生物細(xì)胞利用不同碳源進(jìn)行新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧化還原酶與顯色物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致的顏色變化（吸光度）以及由于微生物生長(zhǎng)造成的濁度差異（濁度），與標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，即可得出最終鑒定結(jié)果。,主要特點(diǎn) ·快速讀取結(jié)果 鑒定板由讀數(shù)儀自動(dòng)讀取吸光值，軟件將該吸光值與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，就可在瞬時(shí)給出鑒定結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果可由系統(tǒng)

25、進(jìn)行自動(dòng)分析、記錄和打印。 ·強(qiáng)大的數(shù)據(jù)庫(kù) Biolog微生物鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)容量是目前世界上最大的，可鑒定包括細(xì)菌、酵母和絲狀真菌在內(nèi)總計(jì)1973種微生物，幾乎涵蓋了所有的人類(lèi)、動(dòng)物、植物病原菌以及食品和環(huán)境微生物。,BIOLOG在植物病原菌鑒定方面 可鑒定常見(jiàn)的假單胞菌(Pseudomonas,77種)、伯克霍爾德菌(Burkholderia)、黃單孢菌屬(Xanthomonas)、果膠桿菌屬(Pe

26、ctobacterium)、食酸菌屬(Acidovorax)、根瘤菌屬(Rhizobium)等近200種植物致病菌，特別適合各農(nóng)業(yè)大學(xué)、研究所及相關(guān)機(jī)構(gòu)進(jìn)行植物病理分析和研究用。,BIOLOG在食品工業(yè)應(yīng)用及研究領(lǐng)域提供大量的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括70多種乳酸菌、30多種雙歧桿菌及各類(lèi)常見(jiàn)的食品必檢的致病菌數(shù)據(jù)庫(kù)，包括沙門(mén)氏菌、李斯特菌、大腸桿菌(含阪崎腸桿菌)、葡萄球菌、彎曲菌、假單胞菌、弧菌、梭菌、志賀氏菌等，用于食品、藥品及化妝品行業(yè)用于致

27、病微生物鑒定、工業(yè)應(yīng)用微生物研究、質(zhì)量控制及產(chǎn)品研發(fā)等。,BIOLOG專門(mén)分開(kāi)提供一個(gè)DP(危險(xiǎn)微生物)數(shù)據(jù)庫(kù)，包含鼠疫耶爾森氏菌、炭疽芽胞桿菌、馬爾他布魯氏菌、土拉弗朗西斯菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌(鼻疽假單孢菌)、類(lèi)鼻疽伯克霍爾德氏菌、蘇云金芽孢桿菌、假結(jié)核耶爾森氏菌、蠟樣芽胞桿菌等12種強(qiáng)致病微生物，適用于國(guó)家疾病控制中心、國(guó)家安全機(jī)構(gòu)及軍事機(jī)構(gòu)用于生物武器檢測(cè)及防治研究。目前廣泛用于美國(guó)軍方進(jìn)行生物恐怖檢測(cè)及預(yù)防研究。,鑒定初始首先

28、按常規(guī)微生物操作方法分離出純種。,鑒定步驟如下：第一步用Biolog專用培養(yǎng)基將純種擴(kuò)大培養(yǎng)。第二步按要求配制一定濁度(細(xì)胞濃度)的菌懸液。第三步將菌懸液接種至微孔鑒定板(Microplate)，培養(yǎng)一定時(shí)間。第四步 將培養(yǎng)后的鑒定板放入讀數(shù)儀中讀數(shù)，軟件自動(dòng)給出鑒定結(jié)果。,植物病原細(xì)菌檢測(cè)和細(xì)菌病害診斷方法,一、癥狀特征,十字花科軟腐病,瓜萎蔫病,,,腫瘤,由細(xì)菌侵染所致病害的病部，無(wú)論是維管束系統(tǒng)受害的，還

29、是薄壁組織受害的，都可以在徒手切片中看到有大量細(xì)菌從病部噴出，這種現(xiàn)象稱為菌溢現(xiàn)象(bacteria exudation，BE)。菌溢現(xiàn)象為細(xì)菌病害特有，是區(qū)分細(xì)菌病害或真菌、病毒病害的最簡(jiǎn)便的手段之一。,二、顯微鏡檢查 （菌溢現(xiàn)象）,菌溢現(xiàn)象操作方法,細(xì)菌病害的病組織，內(nèi)含有大量菌體，可通過(guò)菌溢現(xiàn)象或診斷，具體方法：①取病健組織交界部位一小塊，置于截玻片上。②加一滴無(wú)菌水后，加蓋玻片。③低倍鏡下，暗光，觀察。④可看到病斑切口處

30、有大量細(xì)菌云霧狀涌出。,菌溢現(xiàn)象,1、凝集反應(yīng) 顆粒性抗原如細(xì)菌與其特異性抗體在電解質(zhì)影響下，很快結(jié)合成可見(jiàn)的凝集塊。 載玻片凝集反應(yīng)是最快速的測(cè)定方法：在清潔載玻片上加兩滴生理鹽水配的菌懸液，用移植環(huán)取少量抗血清與其中一滴菌懸液混合，另一滴不加血清作為對(duì)照。經(jīng)3~5分鐘，可以看到原來(lái)均勻懸浮的細(xì)菌凝集成團(tuán)，對(duì)照則不發(fā)生這種變化。 另一種常用方法是試管凝集反應(yīng)，雖然沒(méi)有玻片凝集反應(yīng)快捷，但能測(cè)定血清效價(jià)和作定量研究。,

31、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù),2、酶聯(lián)免疫吸附法 （Enzyme linked immune sorbent assay, ELISA）,該方法是將微量的酶與測(cè)定的抗原或抗體結(jié)合，大大的提高抗原和抗體反應(yīng)的靈敏度。 抗體夾心ELISA法通常比其他ELISA方法敏感2－5倍。 先用抗體包被聚苯乙烯微量滴定板孔，然后加測(cè)定抗原樣本，抗原被抗體吸附，然后將酶聯(lián)抗體加在被吸附的抗原上。最后再加酶的底物，酶催化底物而顯色，用分光光度計(jì)檢

32、測(cè)。,4、核酸雜交及PCR診斷技術(shù),利用核酸鏈間堿基配對(duì)––––核酸雜交來(lái)識(shí)別特定核酸順序的方法。 將一個(gè)預(yù)先分離純化或合成的已知核酸序列片段，加以標(biāo)記，就成為核酸探針(probe)。 用核酸探針可以探測(cè)待查標(biāo)本核酸中與探針具有互補(bǔ)的堿基順序。 如果兩者有互補(bǔ)順序則雜交成功, 結(jié)果陽(yáng)性; 若待查標(biāo)本核酸與探針順序無(wú)關(guān)則雜交失敗, 結(jié)果呈陰性。由于大多數(shù)植物病毒的核酸是RNA, 其探針為互補(bǔ)DNA (complementa

33、ry DNA, cDNA)，稱為cDNA探針。,4.1 核酸雜交,核酸雜交,4.2 PCR診斷技術(shù),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction, PCR）是一種體外擴(kuò)增特異性DNA的技術(shù)，在短時(shí)間內(nèi)可以大量擴(kuò)增核酸。整個(gè)擴(kuò)增包括3個(gè)重復(fù)的步驟：（1）DNA熱變性，雙鏈變單鏈；（2）引物退火，當(dāng)溫度降低時(shí)，兩個(gè)引物分別結(jié)合到靶DNA的兩條鏈的3'末端，（3）引物延伸，在DNA聚合酶的催化下，引物由5&

34、#39;?3'擴(kuò)增延長(zhǎng)。分別和相對(duì)的DNA鏈互補(bǔ)。,Real-time fluorescent PCRREP-PCRImmuno-PCRRAPD-PCRNested-PCR,在植物病原細(xì)菌檢測(cè)和鑒定中應(yīng)用的PCR技術(shù),三、分離培養(yǎng)與致病性測(cè)定 培養(yǎng)基稀釋法或劃線法培養(yǎng)。觀察單個(gè)菌落特點(diǎn)。 將分離的細(xì)菌接種于寄主植物或過(guò)敏性發(fā)應(yīng)植物，觀察所得癥狀，從而完成柯赫氏法則的診斷程序。,四、鏈霉素防治,植

35、物病原細(xì)菌對(duì)鏈霉素敏感，可用于防治細(xì)菌病害。,三、植物病原細(xì)菌的主要類(lèi)群及分類(lèi)地位,五界生物分類(lèi)系統(tǒng)，細(xì)菌屬于原核生物界。 參考：《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌手冊(cè)》,四、主要屬,長(zhǎng)期以來(lái)，植物病原細(xì)菌僅限于5個(gè)屬： 土壤桿菌屬（Agrobacterium）歐氏桿菌屬（Erwinia） 假單胞桿菌屬（Pseudomonas） 黃單胞桿菌屬（Xanthomonas） 棒形桿菌屬（Clavibacter）,

36、五屬細(xì)菌分類(lèi)檢索表,A.革蘭氏染色陽(yáng)性，一般不能游動(dòng)……棒形桿菌屬（Clavibacter）AA.革蘭氏染色陰性，能游動(dòng)。 B.鞭毛極生 C.鞭毛一般多條，在培養(yǎng)基上產(chǎn)生水溶性黃綠色或藍(lán)綠色色素……假單胞桿菌屬（Pseudomonas） CC.鞭毛一般單條，在培養(yǎng)基上產(chǎn)生非水溶性色素……黃假胞桿菌屬（Xanthomonas） BB.鞭毛周生 C.鞭毛1–4條，引起腫瘤……………………土壤桿菌屬（Agrobacteri

37、um） CC.鞭毛多條，引致腐爛或萎蔫………………歐氏桿菌屬（Erwinia）,供試菌株,革蘭氏反應(yīng)陽(yáng)性,桿菌或球菌,形成絲狀細(xì)胞,Streptomyces（鏈霉菌屬）,形成芽孢,36℃生長(zhǎng)，在7％NaCl中生長(zhǎng),Curtobacterium短小桿菌屬,尿酶,Rhodococcus紅球菌屬,Clavibacter棒形桿菌屬,,革蘭氏反應(yīng)陰性,不形成芽孢,Bacillus芽孢桿菌屬；Clostridium梭狀芽孢桿菌屬,+,-,,,

38、,,,,,植物病原細(xì)菌主要屬簡(jiǎn)要檢查方法,好氧性或不活潑性,滑行運(yùn)動(dòng)，在瓊脂平板上鋪開(kāi)生長(zhǎng)，短或長(zhǎng)桿形彎曲、氧化酶陽(yáng)性,以鞭毛游動(dòng),在King‘sB培養(yǎng)基上產(chǎn)生熒光色素,,發(fā)酵性,Cytophaga噬胞菌屬；Flexibacter屈橈桿菌屬,,,,,,,,,,革蘭氏反應(yīng)陰性,不運(yùn)動(dòng)，菌落光滑短桿狀、氧化酶陰性,Flavobacterium黃桿菌屬,,,,溶果膠活性,Erwinia（軟腐組群）,Erwinia（不溶果膠組群

39、）,,Pseudomonas（無(wú)熒光組群）,,,,在1％葡萄糖營(yíng)養(yǎng)瓊脂上為白色菌落，周鞭，致瘤,,Agrobacterium土壤桿菌屬,Xanthomonas黃單胞菌屬,在1％葡萄糖營(yíng)養(yǎng)瓊脂上為黃色菌落，單極鞭,,Pseudomonas（熒光組群）,有益細(xì)菌的利用研究,生物防治 利用其他對(duì)植物無(wú)害的生物來(lái)影響或抑制病原物的生存和活動(dòng)，從而降低病害的發(fā)生率或嚴(yán)重度。（1）抗菌作用(antibiosis)（2）溶菌作

40、用(lysis)（3）競(jìng)爭(zhēng)作用(competition)（4）重寄生作用(hyperparasitism)（5）捕食作用（predation）（6）交互保護(hù)作用(cross protection),Sir Alexander Fleming discovered the antibiotic penicillin. He had the insight to recognize the significance of the

41、inhibition of bacterial growth in the vicinity of a fungal contaminant when most other scientists probably would have simply discarded the contaminated plates.,,Alexander Fleming (1881-1955),亞歷山大·弗萊明英國(guó)細(xì)菌學(xué)家,葡萄球菌,青霉菌

42、,,,,1928年的一天，弗萊明在他的一間簡(jiǎn)陋的實(shí)驗(yàn)室里研究導(dǎo)致人體發(fā)熱的葡萄球菌。由于蓋子沒(méi)有蓋好，他發(fā)覺(jué)培養(yǎng)細(xì)菌用的瓊脂上附了一層青霉菌。這是從樓上的一位研究青霉菌的學(xué)者的窗口飄落進(jìn)來(lái)的。使弗萊明感到驚訝的是，在青霉菌的近旁，葡萄球菌忽然不見(jiàn)了。這個(gè)偶然的發(fā)現(xiàn)深深吸引了他，他設(shè)法培養(yǎng)這種霉菌進(jìn)行多次試驗(yàn)，證明青霉素可以在幾小時(shí)內(nèi)將葡萄球菌全部殺死。弗萊明據(jù)此發(fā)明了葡萄球菌的克星—青霉素。 由于青霉素的發(fā)現(xiàn)和大量生產(chǎn)

43、，拯救了千百萬(wàn)肺炎、腦膜炎、膿腫、敗血癥患者的生命，及時(shí)搶救了許多的傷病員。青霉素的出現(xiàn)，當(dāng)時(shí)曾轟動(dòng)世界。 為了表彰這一造福人類(lèi)的貢獻(xiàn)，弗萊明、錢(qián)恩、弗羅里于1945年共同獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。,青霉素的發(fā)現(xiàn)者—英國(guó)細(xì)菌學(xué)家弗萊明,,圖中央是青霉菌，周?chē)侵虏〖?xì)菌。距青霉素最遠(yuǎn)的細(xì)菌個(gè)大、色濃，活力十足；距青霉菌較近的細(xì)菌個(gè)較小、色較淺，活力較差；而最接近青霉菌的細(xì)菌個(gè)最小、色發(fā)白，顯然已經(jīng)死亡,葡萄球菌這些形如珍珠