慶大霉素

1、發(fā)現(xiàn)歷史 慶大霉素是中國獨立自主研制成功的廣譜抗生素，是產(chǎn)生于無產(chǎn)階級文化大革命中的科技成果。它開始研制于1967年，成功鑒定在1969年底，取名“慶大霉素”，意指慶?！熬糯蟆币约皯c祝工人階級的偉大。慶大霉素[Gentamicin，正泰霉素（gentamycin）]系從放線菌科單孢子屬發(fā)酵培養(yǎng)液中提得，系堿性化合物，是目前常用的氨基糖苷類抗生素。,來源,氨基糖苷類抗生素（Aminoglycosides）是由氨基糖與氨基環(huán)醇通過氧橋連接

2、而成的苷類抗生素。有來自鏈霉菌的鏈霉素等、來自小單孢菌的慶大霉素等天然氨基糖苷類，還有阿米卡星等半合成氨基糖苷類。,抗菌機理 雖然大多數(shù)抑制微生物蛋白質(zhì)合成的抗生素為抑菌藥，但氨基糖苷類抗生素卻可起到殺菌作用，屬靜止期殺菌藥。 慶大霉素能與細菌核糖體30s亞基結(jié)合，阻斷細菌蛋白質(zhì)合成。慶大霉素是為數(shù)不多的熱穩(wěn)定性的抗生素，因而廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基配置。,殺菌特點1.殺菌作用呈濃度依賴性。 2.僅對需氧菌有效，尤其對需氧革蘭陰

3、性桿菌的抗菌作用強。 3.具有明顯的抗生素后效應(yīng)。 4.具有首次接觸效應(yīng)。 5.在堿性環(huán)境中抗菌活性增強。,結(jié)構(gòu)與組分慶大霉素是由絳紅小單孢菌、棘孢小單孢菌等發(fā)酵產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素, 是由2-脫氧鏈霉胺、絳紅糖胺、加拉糖胺組成的多組分混合物, 包括C族、A族、B族、X2族等20多種組分，并以C 族復(fù)合物為主。2-脫氧鏈霉胺分別在4、6 位上通過苷鍵連接絳紅糖胺和加拉糖胺, 因絳紅糖胺C6上的甲基化程度不同, 形成了C1、C2

4、、C1a 3 個主要組分 , 其結(jié)構(gòu)如圖 所示。,這3 個組分中, C1、C2、C1a 的療效和毒性互不相同: C1組分毒副作用最小且不易產(chǎn)生耐藥性, 但療效稍差; C2 和C1a 組分療效高, 但毒性較大且容易產(chǎn)生耐藥性。 性狀：常用其硫酸鹽，為白色或類白色結(jié)晶性粉末；無臭；有引濕性。在水中易溶，在乙醇、乙醚、丙酮或氯仿中不溶。,性質(zhì),溶解度:堿性水溶性抗生素，一般用硫酸鹽。硫酸慶大霉素為白色粉末或者微黃色粉末。容易溶解于水

5、，不溶解于乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙醚以及苯。穩(wěn)定性:對光空氣pH及熱穩(wěn)定。生物活性:為臨床治療革蘭氏陰性菌感染的藥物。,注意事項,(1)應(yīng)監(jiān)測血藥濃度，尤其在新生兒、老年和腎功能不全的患者。慶大霉素的有效治療濃度范圍為4一10μg/ml。應(yīng)避免高峰血藥濃度持續(xù)在12μg/ml以上。但外科、婦科、產(chǎn)科或燒傷患者由于個體差異較大，按計算劑量可能低于最小常用量或超過最大常用量。接受慶大霉素鞘內(nèi)注射者應(yīng)同時監(jiān)測腦脊液內(nèi)藥物濃度。 (2)不

6、能測定血藥濃度時，應(yīng)根據(jù)測得的肌酐清除率調(diào)整劑量。(3)患者應(yīng)給予充足的水分，以減少腎小管損害。 (4)長期應(yīng)用可能導致耐藥菌過度生長。,(5)給予首次飽和劑量(1一2mg/kg)后，有腎功能不全，前庭功能或聽力減退的患者所用維持量應(yīng)酌減：劑量不變，延長給藥間隔時間；或給藥間期不變，每次劑量減少或停用慶大霉素，其維持量可按下式計算：①延長給藥間期(小時)，每次劑量不變(1一2mg/kg)，給藥間期=患者血肌酐值(mg/100ml)

7、×8②減少維持劑量，每8小時給藥一次：每次劑量=患者體重（kg）×常規(guī)用量（mg/kg）/患者血肌酐值(mg/100ml)。由于慶大霉素在體內(nèi)不代謝，主要經(jīng)尿排出，因此腎功能減退的患者中可能引起藥物積聚達中毒濃度。,不良反應(yīng),(1)曾有報道慶大霉素全身應(yīng)用合并鞘內(nèi)注射時引起腿部抽搐、皮疹、發(fā)熱和全身痙攣等。慶大霉素引起腎功能減退的發(fā)生率較妥布霉素為高。 大劑量用藥容易導致水腫(2)發(fā)生率較多者有聽力減退、耳鳴或耳

8、部飽滿感(耳毒性)、血尿、排尿次數(shù)顯著減少或尿量減少、食欲減退、極度口渴(腎毒性)、步履不穩(wěn)、眩暈(耳毒性，影響前庭；腎毒性)。發(fā)生率較低者有呼吸困難、嗜睡、極度軟弱無力(神經(jīng)肌肉阻滯或腎毒性)。 (3)停藥后如發(fā)生聽力減退、耳鳴或耳部飽滿感，需引起注意。不良反應(yīng)與卡那霉素進近似，用量小時反應(yīng)較輕.如用量大，療程長，偶見腸道菌群紊亂，一旦出現(xiàn)即停藥，可恢復(fù)正常.可有白細胞減少，聽力及腎損害.個別病例口周、面部和四肢皮膚發(fā)麻，眩暈,耳鳴

9、.偶有過敏性休克，主要癥狀為呼吸道阻塞及循環(huán)障礙、半數(shù)以上病例經(jīng)搶救無效而死亡，故有人認為該品的最嚴重的不良反應(yīng)為速發(fā)型過敏性休克.可引起羅姆伯格氏癥(閉目難立，暗處和洗臉時站不穩(wěn))中毒癥狀。,耐藥機制,1、產(chǎn)生鈍化酶：如磷酸化酶、腺苷化酶、乙?；浮?、細胞膜通透性下降。3、修飾靶蛋白（p10蛋白）。缺乏主動轉(zhuǎn)運功能：如厭氧菌對氨基糖苷類的耐藥性。,二.制備原理,慶大霉素的生產(chǎn)是采用五級發(fā)酵形式，離子交換樹脂的方法進行產(chǎn)品的分離

10、精制。慶大霉素產(chǎn)生菌絳紅小單孢菌或棘孢小單孢菌經(jīng)孢子制備、搖瓶菌絲培養(yǎng)后接入種子罐，種子經(jīng)過一級、二級、三級、四級擴級培養(yǎng)后接入發(fā)酵罐。發(fā)酵過程中控制溫度、通氣量、pH、補料等各項工藝參數(shù)，4~6天發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)陽離子交換樹脂吸附、洗脫、脫色、濃縮和干燥可得慶大霉素成品。,三. 工藝路線,,四.工藝過程,(一)菌種生產(chǎn)中國內(nèi)常用絳紅小單孢菌，國外常用棘孢小單孢菌、橄攬星小單孢菌。對菌種進行誘變選育，采用的方法有紫外線、離子輻

11、射、快中子、 N離子注入、微波處理、硫酸二乙酯(DES)化學法等。另外，近年來，隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展以及在微生物基因組計劃的推動下，國內(nèi)外對放線菌的抗生素合成、調(diào)控和轉(zhuǎn)運基因已經(jīng)進行了大量卓有成效的研究，因此，通過對慶大霉素生物合成基因的克隆與轉(zhuǎn)移來提高其增產(chǎn)是很有發(fā)展前景的。,（二）孢子制備和種子培養(yǎng),1.孢子制備孢子萌發(fā)培養(yǎng)基(% ) : 1 號培養(yǎng)基: K 2HP4 0. 01 , NaCl 0. 05, Mg SO4 0

12、. 05, 葡萄糖0. 1, 小麥汁2. 0; 2 號培養(yǎng)基: K2HP4 0. 01, NaCl 0. 05, MgSO4 0. 05, 小麥汁2. 0; 3 號培養(yǎng)基: NaCl 0. 05,MgSO4 0. 05, 小麥汁2. 0.,孢子萌發(fā)的影響條件,1、pH值：當小單孢菌發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH 7. 0 時, 菌絲生長快, 慶大霉素合成起步早, 產(chǎn)抗期延長. 同樣是5 天的周期, 而它的發(fā)酵水平最高. 說明慶大

13、霉素代謝合成最適pH 值比孢子萌發(fā)pH 值略高.2、溫度的影響：溫度是孢子萌發(fā)的重要條件, 它影響萌發(fā)的速度和百分率. 菌株培養(yǎng)溫度由30→34℃時, 萌發(fā)率相差幾倍. 當溫度由34→36℃, 大部份菌株發(fā)芽率達最大值, 最適溫度為36℃.3、溶氧對孢子萌發(fā)的影響：溶氧對孢子萌發(fā)也是不可缺少的因素. 振蕩培養(yǎng)12h 的萌發(fā)率相當于靜止培養(yǎng)17h 的狀況. 以相同的培養(yǎng)時間, 前者比后者萌發(fā)率提高30%～45%. 振蕩培養(yǎng)17h,

14、萌發(fā)率高達41%～60% .4、孢子的密度與萌發(fā)的關(guān)系：當?shù)攘颗囵B(yǎng)液中接入不同量的孢子時, 萌發(fā)率隨著密度的增加而相應(yīng)地降低. 這可能與斜面孢子在貯藏過程中菌絲自溶釋放出某些物質(zhì)濃度過大而對孢子萌發(fā)具有抑制作用有關(guān). 同時存在高密度孢子萌發(fā)所需營養(yǎng)顯得不足.5、生長因子對孢子萌發(fā)的影響：出對孢子萌發(fā)最有效的生化因子甘氨酸、纈氨酸、絲氨酸, 經(jīng)雙因子組合試驗, 孢子萌發(fā)率最高可達74. 2% , 由此證明絳紅色小單孢菌孢子萌發(fā)率低的

15、主要因素可能與缺乏某些氨基酸及一些生長因素這些簡單營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān).,2.種子的制備,實驗室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過程稱為實驗室階段的種子培養(yǎng)。,生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在工程上歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段,種子培養(yǎng)基,發(fā)酵培養(yǎng)基,查閱國內(nèi)外關(guān)于慶大霉素生產(chǎn)所用的培養(yǎng)基，歸納起來有二十多種，選擇

16、其中十二種進行研究，按主次順序排列如下：黃豆餅粉>蛋白胨>(NH4)2SO+>淀粉>玉米粉>CaCO3>魚粉>KNO3>豆油>COOL2>合成消沫劑>葡萄糖。發(fā)酵培養(yǎng)基( %) : 葡萄糖0. 5, 玉米淀粉5. 5, 玉米粉1, 黃豆餅粉4, 蛋白胨0. 3 , 魚粉0. 5, CaCO3 0. 6, ( NH4) 2SO4 0. 1 , C0Cl 2 8r/ ml

17、pH 7. 2.,工藝提取,采用732 陽離子交換樹脂，利用離子交換法從發(fā)酵液中提取慶大霉素。最優(yōu)的提取條件為: 發(fā)酵液pH2 ～ 3，吸附時間2 h，解吸劑濃度5%，解吸劑流速0． 4 mL /min。經(jīng)HPLC 測定，發(fā)酵液通過離子交換法分離提取后，慶大霉素純度為92． 5%。離子交換法適用于慶大霉素發(fā)酵液的分離提取，提取液純度達到藥物分析的要求。,提取流程,732 型陽離子交換樹脂是一種強酸型的樹脂，pH 對其活性基團影響不大;

18、 慶大霉素是一種弱堿性的抗生素，pH 對其影響較大。在中性環(huán)境中，它主要以三價陽離子的形式存在，能與陽離子樹脂進行離子交換，而在堿性環(huán)境中，慶大霉素以陰離子的形式存在，與陽離子交換樹脂的交換能力非常弱，導致在堿性條件下吸附率急劇下降。而在酸性環(huán)境中主要以五價陽離子的形式存在，更加穩(wěn)定，親和力較強，所以具有更高的離子交換能力，因而在酸性條件下吸附率比較大。轉(zhuǎn)速、解吸劑流速、解吸劑濃度對其陽離子交換樹脂的最終提取結(jié)果也有影響,五.生物合成

19、,The promoters ( amino acids) of biosynthesis gentamicin w ere screened out by theorthogonal design in the course of producting gentamic in by Micromonospora purpurea. Some amount of glycine, lysine, tyrosine, methionine

20、 was added to the original medium in flask and incubated at 36℃ on the rotary shaker 220r/m for 96h. It was propitious to biosynthesize gentamic in and increased the yield of gentamicin over 30% than control group; the p

21、roduction rate of gentamic in was increased by 40%。,參看教材P251-252,添加氨基酸后其在微生物細胞內(nèi)的作用機理往往可歸納為幾種類型: (1)氨基酸脫去氨基后形成的碳骨架通過特定的代謝途徑進入TCA 循環(huán), 增加了TCA循環(huán)的代謝通量, 從而提高了細胞的能量水平, 促進了細胞生長和代謝產(chǎn)物合成, 因此小單孢菌菌絲粗壯, 細胞染色深, 發(fā)酵液粘稠, 縮短了生長期, 提前進入產(chǎn)素期.

22、 (2)由于氨基酸是一種兩性離子, 具有調(diào)節(jié)胞內(nèi)生理pH值的功能，并能促使pH 最大限度地滿足細胞生理功能的需要，研究證明新方法pH 值明顯高于原工藝, pH 偏堿性更有利于絳紅色小單孢菌細胞的代謝和產(chǎn)素。(3)抑制或激活相關(guān)代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，從而促進目的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高。 大量實驗說明主要是激活初級代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，從而促使在整個發(fā)酵過程中細胞代謝旺盛, 周期縮短，產(chǎn)素率得到明顯提高。 (4)氨基酸通過特定代