微生物限度檢查

1、1,微生物限度檢查法張翠所,2,第一節(jié) 微生物限度檢查概述及限度標(biāo)準(zhǔn),一、 微生物限度檢查的概念和意義 1、微生物限度檢查的概念 微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。 檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。,3,2、微生物限度檢查的意義,（1） 藥品染菌對(duì)使用者的潛在危害 藥品中染菌數(shù)量愈高，其中所含致病菌的幾率愈高，這是造成藥源性感染疾病的直

2、接原因。 藥品染菌還可使其產(chǎn)生霉變、酸敗等理化性質(zhì)改變?cè)斐伤幤肥А⒆冑|(zhì)，甚至產(chǎn)生毒素，危害使用者的健康。 為保證藥品質(zhì)量，必須對(duì)微生物污染進(jìn)行必要的控制和檢驗(yàn)。,4,,（2）藥品染菌反映藥品生產(chǎn)工藝的科學(xué)性、合理性及質(zhì)量管理水平。 微生物限度檢查的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，是對(duì)藥品生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)環(huán)境、質(zhì)量管理及人員素質(zhì)的綜合評(píng)價(jià)依據(jù)之一。 只有優(yōu)良的GMP企業(yè)，才能提供優(yōu)質(zhì)的醫(yī)藥產(chǎn)品，凡工藝條件、生產(chǎn)管理水

3、平、生產(chǎn)人員素質(zhì)差，不注意文明生產(chǎn)的單位和企業(yè)，其生產(chǎn)的藥品，染菌必然嚴(yán)重，不合格率高。,5,二、藥品微生物限度檢查的特殊性和基本條件,1、藥品微生物限度檢查的特殊性（1） 活體細(xì)胞 （2）分布不勻 （3）多數(shù)處于受損狀態(tài) （4）生境復(fù)雜,6,,（1） 活體細(xì)胞 藥品微生物限度檢查以活體菌細(xì)胞為對(duì)象，污染菌在藥品中處于不穩(wěn)定狀態(tài)，可隨存放時(shí)間延長(zhǎng)而死亡，也可在適宜條件下大量繁殖。藥品還可因?yàn)楸旧硇再|(zhì)，存放溫、濕度，

4、暴露空氣等狀態(tài)不一，污染菌發(fā)生變化導(dǎo)致檢出結(jié)果的差異. 由于檢驗(yàn)對(duì)象的這種活體特征，保持供檢樣品污染菌尚存活而又不大量增殖尤為重要。,7,,（2）分布不勻 藥品中微生物特別是在生產(chǎn)企業(yè)后期污染者通常是局部的，非均勻的，同一批產(chǎn)品中不同部位、人員操作、包裝點(diǎn)的不同瓶（盒、袋）常出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果差異。 為提高檢出的陽(yáng)性率，限度檢驗(yàn)的供檢樣品規(guī)定了檢驗(yàn)數(shù)量。,8,,（3）多數(shù)處于受損狀態(tài)

5、 藥品污染菌自生長(zhǎng)過程中受到原料處理、加工、加熱以及藥物本身的影響，有一定的損傷，受損的細(xì)胞在常規(guī)的直接培養(yǎng)中，往往不能及時(shí)復(fù)蘇，進(jìn)入繁殖周期，所得檢驗(yàn)結(jié)果常是“陰性”或計(jì)數(shù)偏低而“符合規(guī)定”的結(jié)論。 因此，在檢驗(yàn)時(shí)須采用一些措施，利于被檢菌的恢復(fù)從而提高陽(yáng)性檢出率。,9,,（4）生境復(fù)雜 由于藥品的種類繁多，劑型多樣，使染菌的生境多樣而復(fù)雜，在某些藥品中大量繁殖，而在另一些藥品中不能生長(zhǎng)。

6、 藥物的pH、滲透壓、含水量以及污染菌的檢查常會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果，如一些非水溶性油劑、軟膏劑，由于其疏水性致使菌細(xì)胞與培養(yǎng)基成分隔離或因缺氧而難以生長(zhǎng)。,10,,2、藥品微生物限度檢查的基本條件 由于污染菌在藥品中的不穩(wěn)定性和諸多影響因素，為真實(shí)地反映藥品的污染狀況，除采用準(zhǔn)確可靠的方法和對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的正確判斷外，尤須注意以下幾項(xiàng)基本條件：,11,,1）使用符合規(guī)定的培養(yǎng)基 使用符合規(guī)定的培養(yǎng)

7、基是限度檢查的最基礎(chǔ)保障。而培養(yǎng)基的適用性檢查尤為重要，2010版藥典明確規(guī)定，實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基必須經(jīng)過適用性檢查，結(jié)果符合規(guī)定方可使用。,12,,2）保持供檢樣品的原污染狀態(tài) 對(duì)供檢樣品提供原始污染狀況的微生物檢查數(shù)據(jù)是限度檢查的基本任務(wù)。 藥品的第二次污染及繁殖或死亡引起的狀態(tài)改變均不能反應(yīng)藥品的微生物真實(shí)質(zhì)量。,13,,3）按規(guī)定抽樣檢驗(yàn) 由于藥品染菌的隨機(jī)性和不均勻性，欲從小量抽樣

8、檢驗(yàn)反映整批藥品的染菌狀況是不可能的。 由于微生物限度檢查是破壞性檢查，檢驗(yàn)一瓶破壞一瓶，增加抽驗(yàn)量及檢驗(yàn)數(shù)量對(duì)提高檢出率無疑是有利的，但抽量過多，生產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)單位難以承受。 因此藥典規(guī)定了檢驗(yàn)量和數(shù)量。,14,,4）適宜的供試液制備方法 正確制備供試液是保證檢查結(jié)果可靠的前提條件，供試液制備的基本要求是，供試品必須均勻分散于供試液中，被檢菌應(yīng)受到必要的保護(hù)。,15,,5）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及對(duì)照實(shí)驗(yàn)

9、 驗(yàn)證的目的主要是考察供檢驗(yàn)品中有無抑菌活性物質(zhì)干擾實(shí)驗(yàn)、檢驗(yàn)方法和培養(yǎng)條件的可行性。若在確立新藥檢驗(yàn)方法及當(dāng)檢驗(yàn)條件變更時(shí)，如藥品的組分、供試液制備方法或培養(yǎng)基變更等可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，須重新做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。 對(duì)一些已確立檢驗(yàn)方法的品種，采用可行的供試液制備方法和固定的培養(yǎng)基，在進(jìn)行常規(guī)法時(shí)可免去驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的繁瑣步驟，制作一些必要的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。通常的對(duì)照實(shí)驗(yàn)有二種，一種是陰性對(duì)照，另一種是陽(yáng)性對(duì)照。,16,,6）嚴(yán)格無菌環(huán)境及操作

10、 實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)和局部潔凈100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行。 進(jìn)行限度檢查時(shí)，操作人員的無菌觀念應(yīng)貫穿全過程，即在檢查過程中的每一空間、每一動(dòng)作、任一器具未經(jīng)滅菌處理都是帶菌的，供檢樣品或接種物與之接觸都會(huì)造成污染，即使在潔凈室內(nèi)操作，仍須嚴(yán)格按照無菌程序操作，避免操作不當(dāng)?shù)奈廴驹斐蓹z驗(yàn)結(jié)果錯(cuò)誤。,17,三、微生物檢查的內(nèi)容和檢驗(yàn)方法,制定不同藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)須按其使用要求、制劑

11、類型、原料性質(zhì)以及生產(chǎn)條件等綜合考慮，對(duì)各種繁多的藥品，各國(guó)藥典均規(guī)定了相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，這些標(biāo)準(zhǔn)的要求基本相同，但不一致。 我國(guó)藥典，根據(jù)藥品使用的要求，可將微生物限度標(biāo)準(zhǔn)分為兩大類：,18,,對(duì)于規(guī)定滅菌的藥品，包括注射劑和輸液劑，以及用于體腔、嚴(yán)重?zé)齻?、潰瘍、出血及眼科用藥等制劑。必須?yán)格無菌，即在規(guī)定檢驗(yàn)量的供檢樣品中不得檢出活微生物。對(duì)于非規(guī)定滅菌藥品，包括常用的口服制劑與局部外用制劑。對(duì)這一部分制劑一般不要求絕對(duì)無菌，

12、允許在規(guī)定量的樣品中，檢出一定限量的微生物，但不得檢出某些控制菌。通常藥品微生物限度檢查的檢驗(yàn)對(duì)象多為此類藥物。此外，與藥品質(zhì)量密切相關(guān)的還有輔料、包裝材料以及生產(chǎn)環(huán)境的檢測(cè)和醫(yī)用材料、器械等也都制定了相應(yīng)的微生物學(xué)限度指標(biāo)。,19,,微生物限度檢查的內(nèi)容和檢驗(yàn)方法包括：（1）染菌量檢查：測(cè)定單位重量（體積或面積）藥品中的細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)和酵母菌數(shù)。制備適宜方法的供試液后，可以采用下列三種方式進(jìn)行檢驗(yàn)： ①平皿法 系列稀釋供試

13、液，分別加入滅菌平皿中，然后傾注瓊脂。 ②涂布法 將系列稀釋的供試液分別涂布于已事先備妥的瓊脂平板上 ③薄膜過濾法 將供試液用薄膜過濾，取出濾膜貼于瓊脂平板或其它培養(yǎng)基中。,20,,（2）控制菌檢查：測(cè)定單位重量（體積或面積）藥品中的糞便污染指示菌和某些特定菌，如大腸埃希菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、梭菌、白色念珠菌、螨等在規(guī)定量的樣品中不得檢出或不超過某限度。 對(duì)于大腸菌群，采用系列稀釋級(jí)供試液，

14、分別定量加置規(guī)定數(shù)量的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄出現(xiàn)產(chǎn)酸或產(chǎn)氣的管數(shù)，按最近似數(shù)（MPN）對(duì)染菌量做出定量估計(jì)。,21,,對(duì)于其它控制菌，通常是將制備好的供試液，按照待檢菌的特性取規(guī)定量直接接種于培養(yǎng)基或經(jīng)薄膜過濾法處理后接種于培養(yǎng)基，分別進(jìn)行增菌、分離培養(yǎng)，在獲得單個(gè)疑似菌株培養(yǎng)物的基礎(chǔ)上作形態(tài)學(xué)、生化及血清學(xué)鑒定。,22,四、檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告及復(fù)試,1. 細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)報(bào)告及復(fù)試 細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)，一般以每1g、lml

15、或l0cm2菌落形成單位數(shù)（colony forming nints, cfu）報(bào)告，特殊藥品可以最小包裝單位報(bào)告。,23,,供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)檢查中，任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，應(yīng)進(jìn)行復(fù)試。 我國(guó)藥典規(guī)定，對(duì)菌落數(shù)測(cè)定當(dāng)一次檢查不合格時(shí)，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)抽樣，獨(dú)立復(fù)試兩次，以三次檢查結(jié)果的平均值報(bào)告菌數(shù)，這是對(duì)染菌處在合格邊緣數(shù)的產(chǎn)品，避免由此引起可能的爭(zhēng)議采取的一種界定方法。,24,,2.控制菌報(bào)告及復(fù)

16、試 大腸菌群的最近似數(shù)MPN值（Most probable number），它是通過概率計(jì)算的近似值也并非精確數(shù)量，一般以每1g或1ml應(yīng)小于多少個(gè)報(bào)告。 控制菌如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌及梭菌的檢查結(jié)果以每1g、lml 或l0cm2為單位報(bào)告，沙門氏菌是以10g或10ml 為單位報(bào)告。 特殊藥品可以最小包裝單位報(bào)告。 供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢

17、出結(jié)果為準(zhǔn)，不再?gòu)?fù)試。,25,,3.微生物限度檢查報(bào)告 若供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)、控制菌三項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品在該實(shí)驗(yàn)條件下符合規(guī)定； 若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品在該實(shí)驗(yàn)條件下不符合規(guī)定。,26,五、微生物檢查流程舉例,不同給藥途徑的供試品，標(biāo)準(zhǔn)要求不一樣，因而需要檢查的項(xiàng)目也有所不同，整個(gè)試驗(yàn)流程就不同。 下面我們以化藥直腸給藥的栓劑為例。

18、 整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程如圖6-1所示。,27,,（1）查標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)樣品給藥途徑，確定檢查項(xiàng)目，方法和所用的實(shí)驗(yàn)用具和培養(yǎng)基；（2）培養(yǎng)基配制、樣品的前處置、實(shí)驗(yàn)用具的前處置；（3）供試品的制備；（4）檢查各項(xiàng)目：細(xì)菌霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌檢查、白色念珠菌檢查；（5）將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌檢查用培養(yǎng)基分別劃線于相應(yīng)的選擇性平板上；,28,,（6）觀察上述劃線平板上的菌落是否為疑似菌，如果

19、無菌生長(zhǎng)或無疑似菌報(bào)告未檢出，如果有疑似菌則要經(jīng)過下一步的確證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)的控制菌，則報(bào)告檢出；（7）細(xì)菌霉菌及酵母菌，按照菌落報(bào)告規(guī)則計(jì)數(shù)，如果菌落數(shù)小于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定數(shù)，則直接計(jì)數(shù)即可；如果計(jì)數(shù)結(jié)果超過了標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定數(shù)，則須進(jìn)行復(fù)試；（8）寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。,29,第二節(jié) 前處置及供試液的制備,一、 檢驗(yàn)樣品前處置 樣品包裝的完整性和樣品的有效性關(guān)系到檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。完整性要求檢測(cè)樣品的最小包裝原始、完好，沒有任何

20、破損。有效性要求檢測(cè)樣品編號(hào)的唯一性和可追溯性，以及樣品內(nèi)在的微生物能保持其原始數(shù)量和原始種類。,30,,1、樣品的接收 檢查樣品的完整性，核對(duì)品名、規(guī)格、批號(hào)、有效期、生產(chǎn)單位等信息； 加貼樣品狀態(tài)標(biāo)識(shí)（待檢、在檢、檢畢、留樣），并逐一登記。,31,,2、樣品的儲(chǔ)存和保管 (1) 應(yīng)有適宜的樣品儲(chǔ)存場(chǎng)所存放樣品。要根據(jù)樣品的儲(chǔ)存要求進(jìn)行存放，一般宜儲(chǔ)存于陰涼干燥處，需要冷藏的樣品應(yīng)置冰箱冷藏室保存，并嚴(yán)格監(jiān)

21、控、記錄存放環(huán)境的溫濕度。 (2) 樣品在傳遞、檢驗(yàn)過程中應(yīng)妥善保管，在檢樣品避免損壞、丟失和存放不當(dāng)，影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。,32,,3、樣品檢驗(yàn)前的處理 (1) 去掉樣品的外包裝，注意唯一性標(biāo)識(shí)要轉(zhuǎn)貼到最小包裝上，防止實(shí)驗(yàn)時(shí)混淆。 (2) 樣品進(jìn)入無菌室前，應(yīng)用適宜的消毒液對(duì)其外表進(jìn)行擦拭消毒處理，并經(jīng)紫外線照射30分鐘后進(jìn)入操作間。,33,,二、 儀器及用具的處置 儀器、用具使用前，應(yīng)洗滌干凈，吸管、量筒、

22、試管、培養(yǎng)皿等玻璃制品不掛水滴，無殘留抗菌物質(zhì)，并經(jīng)無菌化處理。 (1)干熱滅菌物品：勻漿杯、剪刀、鑷子、不銹鋼藥勺、吸管、量筒、試管、培養(yǎng)皿、研缽等金屬、玻璃、陶瓷制品均可在干燥內(nèi)箱內(nèi)干熱滅菌。通常加熱至160℃恒溫2小時(shí)可完全滅菌。,34,,(2)高壓蒸汽滅菌物品：為最可靠、最廣泛使用的滅菌方法之一。凡是耐高溫和潮濕的物品如培養(yǎng)基、無菌衣、金屬、玻璃器材、陶瓷制品、傳染性污物等可用本法滅菌。將需要滅菌的物品于0.11MPa, 12

23、1℃滅菌15分鐘后方可使用。,35,,三、 培養(yǎng)基的處置 （1）培養(yǎng)基的配制 一般采用商品脫水培養(yǎng)基，按照使用說明書進(jìn)行配制，配制培養(yǎng)基時(shí)稱量要迅速，以免吸潮而影響稱量的準(zhǔn)確性，同時(shí)為避免增加培養(yǎng)基中的金屬離子及其他微量化學(xué)元素而影響微生物的生長(zhǎng)，所用器具應(yīng)為潔凈玻璃器皿，所用溶解用水為去離子水或蒸餾水。 每個(gè)容器內(nèi)，培養(yǎng)基的裝量應(yīng)不超過容器體積的三分之二，以防加熱滅菌時(shí)培養(yǎng)基污染瓶塞。,36,,（2）培養(yǎng)基的

24、pH值 培養(yǎng)基的pH值應(yīng)符合規(guī)定，否則必需 校正。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值，使其高于規(guī)定值的0.2，滅菌后可達(dá)到規(guī)定的pH值，測(cè)定時(shí)溶液溫度應(yīng)為20～25℃，調(diào)節(jié)PH值可用1mol/L氫氧化鈉溶液、1mol/L鹽酸溶液。分裝好的培養(yǎng)基應(yīng)及時(shí)密封, 必須在配制后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行滅菌處理。,37,,（3）特殊配制的培養(yǎng)基 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，作為厭氧和好氧檢查用培養(yǎng)基需要特別注意。培養(yǎng)基應(yīng)經(jīng)煮沸后分裝至適宜的容

25、器中，其裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基的氧化層(粉紅色)不超過培養(yǎng)基深度的1/2, 在供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層的顏色不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則須置100℃水浴中加熱至粉紅色消失(不超過20分鐘)，迅速冷卻。培養(yǎng)基只限加熱一次，并防止被污染。,38,,（4）采用合理的滅菌方式 培養(yǎng)基采用不適當(dāng)?shù)募訜岷蜏缇鷹l件，有可能引起顏色變化，透明度降低，瓊脂凝固力降低或pH改變,因此滅菌應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序進(jìn)行。,3

26、9,四、供試液制備的基本知識(shí),1、供試品檢驗(yàn)量和檢驗(yàn)數(shù)量(1) 檢驗(yàn)量 檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g 、ml 或cm2）。 除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗(yàn)量為10g 或10ml；膜劑為100 cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。 要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加20g 或20ml （其中10g或10ml 用于陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)）。,40,,(2) 檢驗(yàn)數(shù)量 檢驗(yàn)時(shí),應(yīng)從2

27、 個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少于4 片。 一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量（兩個(gè)以上最小包裝單位）的3倍量供試品。,41,,2、稀釋劑 各劑型及原輔料的供試品，一般均需用稀釋劑經(jīng)稀釋后作為供試液，對(duì)于液體制劑可以不稀釋，直接用原液作為供試液。常用的稀釋劑有：,42,,(1) 0.9%氯化鈉溶液 (2) pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 氯化鈉胨水緩沖液可調(diào)節(jié)供試液pH至近中性，其中蛋白胨對(duì)

28、菌細(xì)胞有保護(hù)作用，有利于菌數(shù)及控制菌的測(cè)定，為最常用的稀釋劑?？梢园垂┰嚻返男再|(zhì)加入聚山梨酯80的稀釋劑對(duì)含油性供試品具有助溶作用。(3) pH6.8磷酸鹽緩沖液 適用于腸溶制劑(4) pH7.6磷酸鹽緩沖液 供結(jié)腸制劑做稀釋用,43,,3、供試液制備的基本要求 根據(jù)供試品的理化性質(zhì)及特性，采用經(jīng)驗(yàn)證的方法制備成均勻的供試液，不得改變污染微生物的數(shù)量和種類，其要求如下：（1）供試液的制備，從取樣至制備呈均勻的供

29、試液，必須在符合規(guī)定的潔凈級(jí)無菌室內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)的全過程必須嚴(yán)格無菌操作，防止再污染。,44,,（2）采用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作供試品的稀釋劑，或根據(jù)供試品的理化性質(zhì)加入經(jīng)驗(yàn)證的適宜的助溶劑、乳化劑、中和劑、使其成為均勻的溶液、混懸液或乳濁液。（3）含有抑菌成分的供試品，應(yīng)按其性質(zhì)減除抑菌活性對(duì)試驗(yàn)的干擾并經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)。（4）供試品按驗(yàn)證方法制備成供試液后至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過1小時(shí)。,45,五、供試液的制備方法,采

30、用經(jīng)驗(yàn)證的供試液制備方法，可采用以下1種方法，也可多種方法聯(lián)合應(yīng)用。勻漿儀：利用勻漿儀高速旋轉(zhuǎn)可將固體供試品快速研細(xì)，將油性基質(zhì)的軟膏或易吸水的膠囊劑制備成均勻的供試液。該法快捷、高效、均質(zhì)、效果好，不易造成污染，為藥典優(yōu)選的方法。研磨法：利用研缽將固體供試品研細(xì)，將油性基質(zhì)的軟膏劑制備成均勻的供試液。本法勞動(dòng)強(qiáng)度大，費(fèi)時(shí)，開放式研磨，暴露時(shí)間長(zhǎng)易造成污染。,46,,振蕩器法：將供試品及稀釋劑置入滅菌錐形瓶?jī)?nèi)，置于振蕩器上震蕩，使固

31、體供試品分散、均質(zhì)。本法簡(jiǎn)便，但對(duì)水丸劑等堅(jiān)硬的供試品效果欠佳，分散期長(zhǎng)。乳化法：適用于非水溶性供試品如以凡士林為基質(zhì)的供試品的供試液的制備。在供試品中加入適宜的乳化劑、稀釋劑，使用乳化劑的種類和數(shù)量必須經(jīng)過驗(yàn)證。,47,,萃取法：取供試品，加入無菌十四烷酸異丙酯，使油質(zhì)溶化，萃取，以水層作為供試液。適用于以凡士林為基質(zhì)的軟膏等供試品。加滅活劑：根據(jù)供試品含抑菌成分的理化性質(zhì)，加入適宜的滅活劑，以消除其抑菌活性，加入滅菌劑的種類和量

32、必須通過驗(yàn)證。,48,常用制備方法如下： 1.液體供試品 取供試品10ml，加稀釋液至100ml，混勻，作為1:10供試液。 油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻。 水溶性液體制劑常用混合的供試品原液作為供試液。,49,2.固體、半固體或黏稠性供試品 取供試品10g ，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至1OOml ，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1:10 的供試液。必要時(shí)加適量的無菌聚山

33、梨酯80， 并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。,50,3.需要特殊方法制備供試液的供試品 （1）非水溶性供試品方法1：稱供試品5g（或5ml），加至含溶化的（溫度不超過45℃）5g司盤80、 3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌均勻后，慢慢加入45℃的稀釋液至100 ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1：20供試液。,51,方法2 取供試品10g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯（必要時(shí)

34、可增加用量）的適宜容器中，充分振搖，使供試品溶解，然后加入45℃的稀釋液100ml，振搖5~10分鐘，萃取，靜置使油水明顯分層，取水層作為1：10供試液。,52,,油劑 取供試品10ml ，加入無菌聚山梨酯80 5～8ml 搖勻，再加入稀釋劑至100ml ，作為l:10 的供試液。栓劑 取供試品10g ，置滅菌錐形瓶中，加適量稀釋劑，置45℃水浴保溫10min,使溶，加入無菌聚山梨酯80 5～8ml 振搖使之乳化，再加入稀釋劑至1

35、00ml ，搖勻，作為l:10 的供試液。,53,（2）膜劑供試品取供試品100cm2，剪碎，加100ml稀釋液（必要時(shí)可增加用量），浸泡，振搖，作為1：10的供試液。(3) 腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品10g，加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液(用于腸溶制劑）或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑）至100 ml，置 45℃水浴中，振搖，使溶解，作為1：10的供試液。,54,（4）氣霧劑、噴霧劑供試品取規(guī)定量供試品，置冰凍室

36、冷凍約1小時(shí)，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液，加至適量的稀釋劑（若含非水溶性成份，加適量的無菌聚山梨酯80）中，混勻（此液即為供試品原液），取相當(dāng)于10g或10ml的供試品，再稀釋成1：10的供試液。,55,（5）貼膏劑供試品 取規(guī)定量供試品，去掉貼膏劑的保護(hù)層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。

37、用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振搖至少30分鐘，制成供試液。也可采用其他適宜的方法制備成供試液。,56,（6）具抑菌活性的供試品 當(dāng)供試品有抑菌活性時(shí)，采用下列方法進(jìn)行處理，以消除供試液的抑菌活性，再依法檢查。常用的方法如下。,57,① 培養(yǎng)基稀釋法 取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)

38、的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測(cè)定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)時(shí)，取同稀釋級(jí)的供試液2ml，每1ml可等量分注多個(gè)平皿（2個(gè)、5個(gè)或10個(gè)平皿中 （每皿0.5ml、0.2ml、0.1ml），傾注瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每1ml供試液所注的平皿中生長(zhǎng)的菌落數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)，計(jì)算每1ml供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告菌數(shù)；控制菌檢查時(shí)，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。該法只適用抑菌作用不強(qiáng)的供試品。,58,② 離心沉

39、淀法 取一定量的供試液，500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，取全部上清液混合。用于細(xì)菌檢查。（取消了離心沉淀集菌法，該法回收率達(dá)不到要求）,59,③ 薄膜過濾法 見細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)項(xiàng)下的方法。（將在后面的章節(jié)中做詳細(xì)介紹。）,60,,④ 中和法   凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養(yǎng)基中。表6-l 常見干擾物的中和劑或滅活方法,

40、61,第三節(jié)、細(xì)菌、霉菌及酵母菌,一、 概述 1．基本概念 藥品細(xì)菌數(shù)測(cè)定是微生物的定量檢查，是用來判斷藥品被細(xì)菌污染程度和衛(wèi)生質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，也是檢測(cè)藥品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。 細(xì)菌計(jì)數(shù)是指在一定條件下（如需氧情況、營(yíng)養(yǎng)條件、pH值、培養(yǎng)溫度和時(shí)間等）每1g、1ml、10cm2供試液經(jīng)培養(yǎng)后所生長(zhǎng)的菌落數(shù)。 所謂一定條件是按我國(guó)藥典規(guī)定，在需氧或厭氧條件下，30～35℃，一般培養(yǎng)72小時(shí)，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂

41、培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的細(xì)菌菌落數(shù)。細(xì)菌數(shù)的測(cè)定方法有多種；平皿法、薄膜過濾法、涂布法、MPN法是國(guó)內(nèi)外藥典收載的常用方法。,62,,2．菌落數(shù)測(cè)定的意義 藥品污染細(xì)菌的數(shù)量，是評(píng)價(jià)藥品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)。其意義可概括如下：（1）藥品染菌量與藥品的有效性相關(guān)。 微生物在其污染的藥品是出于動(dòng)態(tài)的不穩(wěn)定的狀態(tài)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，它們可能暫時(shí)處于停滯或逐漸趨于死亡。 但也可能在適宜的條件下

42、，以藥物為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖，其結(jié)果使藥物產(chǎn)生一系列的物理和化學(xué)變化：外觀顏色的改變，潮解，氣味等；微生物對(duì)藥物的降解作用，使其有效成分迅速破壞、變質(zhì)而失去療效，藥物中污染細(xì)菌的數(shù)量與上述質(zhì)量變化有著必然的因果聯(lián)系，藥物中污染細(xì)菌數(shù)量越多，藥物變質(zhì)而迅速失效的可能性越大。尤其是有些細(xì)菌的分解產(chǎn)物、毒素，具有極強(qiáng)的毒性，直接危害人類的身體健康。,63,,（2）藥品染菌量與藥品的安全性相關(guān)。 藥品染菌越多，致病性微生物的污染

43、可能性越大。 有人研究細(xì)菌數(shù)量和大腸菌群檢出率的關(guān)系，結(jié)果證明，藥品中細(xì)菌數(shù)量越多，大腸菌群檢出的幾率也就越高。大腸菌群的檢出，即意味著其它腸道致病菌存在的可能性增加。 有資料表明，不同細(xì)菌數(shù)和各種致病菌的相互關(guān)系，例如細(xì)菌數(shù)（1～5）Χ104時(shí)，沙門菌陽(yáng)性率為8%，產(chǎn)氣莢膜梭菌陽(yáng)性率為3%，金黃色葡萄球菌陽(yáng)性率為57%。細(xì)菌數(shù)高，致病菌污染明顯增加，有可能直接危害人體健康。,64,,（3）藥品染

44、菌量是藥品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。細(xì)菌數(shù)是評(píng)價(jià)企業(yè)綜合管理水平的依據(jù)。因?yàn)橐ＷC藥品的衛(wèi)生質(zhì)量，必須認(rèn)真做到全面的質(zhì)量管理，即是考量管理人員水平、生產(chǎn)人員素質(zhì)、科學(xué)管理的標(biāo)尺。,65,,二、 計(jì)數(shù)方法1、基本計(jì)數(shù)方法 計(jì)數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時(shí)，按已驗(yàn)證的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測(cè)定。按計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證試驗(yàn)確認(rèn)的程序進(jìn)行供試液制備。用稀釋液稀釋成1 : 10 、1:l00 、l:100

45、0 等稀釋級(jí)的供試液。(1)平皿法1)常規(guī)法：取經(jīng)驗(yàn)證的低稀釋級(jí)的供試液lml ，置直徑90mm 的無菌平皿中，注入15～20ml 溫度不超過45 ℃ 的融化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2 個(gè)平板。,66,,2)培養(yǎng)基稀釋法：取經(jīng)驗(yàn)證的低稀釋級(jí)的供試液lml ，等量分注于2個(gè)（2皿法，每皿0.5ml）、5個(gè)(5皿法，每皿0.2ml)或10個(gè)(10

46、皿法，每皿0.1ml)直徑90mm 的無菌平皿中， 其它同上。陰性對(duì)照試驗(yàn)  取試驗(yàn)用的稀釋液lml ，置無菌平皿中．注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2 個(gè)平板，均不得有菌生長(zhǎng)。,67,,2、薄膜過濾法 采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45μm ，直徑一般為50mm ，若采用其他直徑的濾膜．沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。 選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生

47、物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。,68,,水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。 為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。 供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml 。總沖洗量不得超過1000ml.， 以避免濾膜

48、上的微生物受損傷。,69,,取相當(dāng)于每張濾膜含lg 、lml或10c cm2供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每1g 、lml 或10 cm2所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液lml 進(jìn)行試驗(yàn)。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證”。 沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上

49、培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。陰性對(duì)照試驗(yàn) 取試驗(yàn)用的稀釋液lml，照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。,70,,(2)培養(yǎng)和計(jì)數(shù)  培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu 。,71,,3、 培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù) 1)培養(yǎng)時(shí)間： 除另有規(guī)定外，細(xì)菌30～35℃培養(yǎng)3 天，逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，如菌落極小，不易辨認(rèn)，可

50、延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至5 天； 霉菌、酵母菌培養(yǎng)5 天，逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，必要時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7 天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。,72,,2)菌落計(jì)數(shù)： 一般將平板置菌落計(jì)數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點(diǎn)計(jì)，以透射光襯以暗色背景，仔細(xì)觀察。 勿漏計(jì)細(xì)小的瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生 長(zhǎng)的菌落。 注意細(xì)菌菌落、霉菌菌落和酵

51、母菌菌落之間，以及菌落與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡、油滴等的區(qū)別。 必要時(shí)用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察，或挑取可疑物涂片鏡檢。,73,,若平板上有2各或2個(gè)以上菌落重疊，肉眼可辨別時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)； 若平板生長(zhǎng)有鏈狀或片狀、云霧狀菌落，菌落間無明顯界限，一條鏈、片作為一個(gè)菌落，但若鏈、片上出現(xiàn)性狀、與鏈、片狀菌落不同的可辨菌落時(shí)，仍應(yīng)分別計(jì)數(shù)，若生長(zhǎng)蔓延的較大的片狀菌落或花斑樣菌

52、落，其外緣有若干性狀相似的單個(gè)菌落，一般不宜作為計(jì)數(shù)用。,74,,菌落生長(zhǎng)呈蔓延趨勢(shì)者，細(xì)菌需在24小時(shí)，霉菌需在48小時(shí)做初步點(diǎn)計(jì)。 點(diǎn)計(jì)霉菌菌落時(shí)，輕輕翻轉(zhuǎn)平板，勿反復(fù)翻轉(zhuǎn)，否則使早期形成的孢子散落在平板的其他位置，又萌生新的霉菌菌落，導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差。,75,,3)選擇計(jì)數(shù)結(jié)果： 點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于15 ．則

53、兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差l倍或以上。 一般營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)；含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定酵母菌數(shù)，合并計(jì)數(shù)。,76,,在特殊情況下，若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)。 然后將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌及酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)，

54、與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。,77,,4、菌數(shù)報(bào)告規(guī)則1)常規(guī)法：細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu 、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu 的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。當(dāng)僅有1個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告菌落數(shù)；當(dāng)有2個(gè)或2個(gè)以上稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋

55、倍數(shù)的值報(bào)告1g、lml 或10cm2供試品中所含的菌數(shù)。,78,,如各稀釋級(jí)的平板均無菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1 時(shí)，以＜1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)據(jù)報(bào)告。菌落數(shù)大于100時(shí)，取兩位有效數(shù)字報(bào)告，第三位按數(shù)字修約規(guī)則處理。,79,,2)培養(yǎng)基稀釋法：每份供試液所加注平板點(diǎn)計(jì)的菌落之和，即為每1ml菌落數(shù)，共得2組數(shù)據(jù)。以2份低稀釋級(jí)供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍