生物樣品前處理

1、生物樣品前處理,制作人：葉超,,,研究背景,,生物樣品種類,目錄,生物樣品儲(chǔ)存,生物樣品預(yù)處理,克服基質(zhì)效應(yīng)方法,生物樣品中藥物的分析測(cè)定是定量描述藥物體內(nèi)過(guò)程、獲得藥代參數(shù)的重要手段之一,,藥物濃度低（血液中藥物濃度、一般處于ng-pg級(jí)水平）,干擾組分多（血液成分及其復(fù)雜，包括基質(zhì)，內(nèi)源性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，含有數(shù)百乃至幾千種化合物）,藥物在體內(nèi)除原型還有代謝產(chǎn)物以及和內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合多種形式存在,,體內(nèi)生物樣品分析特點(diǎn),體內(nèi)

2、生物樣品分析特點(diǎn),生物樣品種類,,生物樣品種類選取的原則,能夠反應(yīng)出藥物濃度與藥物效應(yīng)之間的關(guān)系易于獲取便于處理、適合分析根據(jù)不同目的要求進(jìn)行選取,,,,,血液（全血、血漿、血清）尿液、唾液、膽汁、乳汁、腦脊液、淋巴液、汗液等,非均勻生物樣品,心、肝、腎、脾、肺、腦、胃、腸、子宮、肌肉、皮膚等組織、器官,全血,血漿,血清,選擇血漿or 血清,選擇血漿理由：1)一般血漿中藥物濃度高于血清中藥物濃度2)血清形成過(guò)程中，血塊凝固時(shí)

3、，往往易造成吸附損失3)血清需要采血放置一段時(shí)間才可制得，對(duì)不穩(wěn)定的化合物影響較大4)血漿則可經(jīng)采血后立刻離心，分離血漿低溫保存,選擇血清理由：1)血漿中蛋白稍微多，可能會(huì)在SPE中產(chǎn)生堵塞柱子情況2)血漿中含有抗凝物質(zhì)（肝素或EDTA)可能會(huì)干擾化合物檢測(cè),,,生物樣品的儲(chǔ)存,,一、冷藏或冷凍,采樣后除了立即分析外，為防止藥物發(fā)生變化，應(yīng)：短期保存，可4℃冷藏長(zhǎng)期保存，可-20℃冷凍，不要反復(fù)凍融（大部分藥物）-80℃，

4、阿莫西林等抗生素,,二、有時(shí)，還應(yīng)考慮加入穩(wěn)定劑,酶抑制劑：一些酯類藥物，如普魯卡因、阿糖胞苷，易受血漿酯酶作用而發(fā)生水解，而應(yīng)在采樣后立即加入酶抑制劑如氟化鈉?？寡趸瘎阂恍┮籽趸奈镔|(zhì)，可加入VC或其它氧化劑。如血漿中的兒茶酚類藥物常規(guī)保存僅4周，若加入適量的VC，則能保存10周。,鹽酸班布特羅（前藥）,,體內(nèi)膽堿酯酶的作用下緩慢代謝,,阻斷水解,毒扁豆堿(膽堿酯酶抑制劑）,特布他林（代謝產(chǎn)物）,生物樣品的儲(chǔ)存和預(yù)處理(添加

5、酶抑制劑),生物樣品的儲(chǔ)存和預(yù)處理(避光）,生物樣品的儲(chǔ)存和預(yù)處理(PH值和溫度）,,,生物樣品預(yù)處理目的,,,,1,2,3,將藥物從綴合物（尿）或結(jié)合物中釋放出來(lái)，以測(cè)定藥物濃度,將微量藥物從復(fù)雜介質(zhì)中純化、富集起來(lái),防止分析儀器的污染，提高測(cè)定靈敏度和選擇性,生物樣品常用的處理方法,,,,,,,,,,,,,,,,一,二,三,沉淀蛋白(PPT),液液萃取(LLE),固相萃取(SPE),主要考慮生物樣品的種類、被測(cè)藥物的性質(zhì)和測(cè)

6、定方法三個(gè)方面的問題：,沉淀蛋白,通過(guò)沉淀蛋白質(zhì)可以使結(jié)合的藥物釋放出來(lái)，達(dá)到對(duì)待測(cè)組分的提純和純化,有機(jī)溶劑沉淀法,加入中性鹽,有機(jī)酸,加入鋅鹽或銅鹽沉淀劑,酶解法,有機(jī)溶劑沉淀法,,原理,加入水溶性有機(jī)溶劑，可使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化,,常用有機(jī)溶劑種類,乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、四氫呋喃等,,操作實(shí)例,50μl 血漿+150μl甲醇 渦旋1min 3500rpm離心10min

7、 取上清液進(jìn)樣分析,有機(jī)溶劑沉淀法實(shí)例,奧氮平,有機(jī)溶劑沉淀法,,血漿或血清與有機(jī)溶劑的體積比為1:1~3，就可以將90%以上的蛋白質(zhì)除去，采用低溫低速3500r/min離心10min便可將析出的蛋白質(zhì)完全沉淀。,經(jīng)驗(yàn)總結(jié),,優(yōu)點(diǎn),操作簡(jiǎn)單，快速，精密度好，為方法開發(fā)中優(yōu)先考慮使用的，特別在LC-MS方法中幾乎使用于所有小分子化合物，無(wú)論其極性大小化合物回收率接近100%，幾乎所有小分子化合物都被提取，尤其適用于代謝產(chǎn)物鑒定,

8、,缺點(diǎn),只適用于樣品中濃度較高的藥物測(cè)定；樣品處理后仍然存在很多干擾物質(zhì)，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾；殘余的雜質(zhì)會(huì)堵塞色譜柱，污染儀器,加入強(qiáng)酸,,原理,當(dāng)PH低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)以陽(yáng)離子形式存在，加入強(qiáng)酸，可與蛋白質(zhì)陽(yáng)離子形成不溶性鹽沉淀。,,常用有機(jī)溶劑種類,10%三氯醋酸， 10%高氯酸等,,經(jīng)驗(yàn)總結(jié),血清與強(qiáng)酸的比例為1:0.6混合，高速離心，就可除去蛋白質(zhì)在酸性條件下分解的藥物不宜本法除蛋白,頭孢地尼,內(nèi)標(biāo) 頭孢克洛,加入強(qiáng)酸

9、實(shí)例,酶解法,,原理,在測(cè)定酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢固的藥物，需用酶解法，最常用的酶是蛋白水解酶的枯草菌溶素，,,優(yōu)點(diǎn),可避免某些藥物在酸、及高溫條件下降解：對(duì)與蛋白質(zhì)結(jié)合牢固的藥物（保泰松、苯妥英鈉)，可顯著改善回收率,加入中性鹽,,原理,加入中性鹽，使溶液的粒子強(qiáng)度發(fā)生變化。中性鹽能將與蛋白質(zhì)水合的水置換出來(lái)，從而使蛋白質(zhì)脫水而沉淀。,,常用中性鹽種類,飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽、枸櫞酸鹽,,操作實(shí)例,血清和飽和硫酸銨的比例為1:

10、2，混合，離心10000r/min 1-2min，即可除去90%以上蛋白質(zhì),生物樣品常用的處理方法,,,,,,,,,,,,,,,,一,二,三,沉淀蛋白(PPT),液液萃取(LLE),固相萃取(SPE),主要考慮生物樣品的種類、被測(cè)藥物的性質(zhì)和測(cè)定方法三個(gè)方面的問題：,液-液提取方法（LLE）,可以根據(jù)藥物分子與基質(zhì)之間的極性差異，使用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑提取藥物，可一次性除去大部分雜質(zhì),LLE方法需是考慮的問題,,一、溶劑的選擇原則,相

11、似相溶原理進(jìn)行選用沸點(diǎn)低、易于揮散和濃集無(wú)毒、不易乳化具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性和惰性和水不相溶,常用液-液萃取溶劑,,正己烷叔丁基甲醚乙醚乙酸乙酯正丁醇,,極性增加,,二、有機(jī)溶劑和水相的體積比,有機(jī)溶劑相和水相的體積比1:1或2:1，由實(shí)際情況決定，文獻(xiàn)中有10:1以上,,三、水相的PH值,對(duì)于堿性藥物，最佳PH要高于藥物PKa1-2單位，對(duì)于酸性藥物，最佳PH要低于PKa1-2單位，使藥物分子以非電離的形式存在，從而

12、更易溶于有機(jī)溶劑中,操作實(shí)例,LLE方法操作實(shí)例,,,萃取劑,LLE方法操作實(shí)例,待測(cè)藥物：氯雷他定,內(nèi)標(biāo)：地西泮,LLE方法總結(jié),,優(yōu)點(diǎn),選擇性高，可除去大部分雜質(zhì)對(duì)有機(jī)溶劑蒸發(fā)后復(fù)溶，可以對(duì)樣品進(jìn)行濃縮樣品較干凈，對(duì)儀器污染小不同PH體系中與不同的萃取劑組合，可控制回收率，并降低基質(zhì)效應(yīng),,缺點(diǎn),操作繁瑣，不能自動(dòng)化易乳化一般提取回收率較低不適用于極性大或者易揮發(fā)的化合物的提取由于需要揮發(fā)有機(jī)溶劑，對(duì)于熱不穩(wěn)定的化合物

13、也不太適合，容器吸附的化合物也有一定的困難對(duì)于極性相差較大的化合物同時(shí)提取困難,生物樣品常用的處理方法,,,,,,,,,,,,,,,,一,二,三,沉淀蛋白(PPT),液液萃取(LLE),固相萃取(SPE),主要考慮生物樣品的種類、被測(cè)藥物的性質(zhì)和測(cè)定方法三個(gè)方面的問題：,固相萃取技術(shù)(SPE),固相萃取(Solid Phase Extraction，簡(jiǎn)稱SPE)是從八十年代中期開始發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)樣品前處理技術(shù)。由液固萃取和液相色

14、譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來(lái)。主要通過(guò)固相填料對(duì)樣品組分的選擇性吸咐及解吸過(guò)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分離，純化和富集。主要目的在于降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)靈敏度,固相萃取技術(shù)基本原理和方法,,基本原理,采用選擇性吸附、選擇性洗脫的方式對(duì)樣品進(jìn)行富集、分離、純化，是一種包括液相和固相的物理萃取過(guò)程；也可以將其近似地看作一種簡(jiǎn)單的色譜過(guò)程,,,較常用的方法是使液體樣品通過(guò)一吸附劑，保留其中被測(cè)物質(zhì)，再選用適當(dāng)強(qiáng)度溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少量良溶劑洗脫被測(cè)物質(zhì)

15、，從而達(dá)到快速分離凈化與濃縮的目的也可選擇性吸附干擾雜質(zhì)，而讓被測(cè)物質(zhì)流出,基本方法,固相萃取分離類型,,反相固相萃取,硅膠上鍵合C18，C8，C2，苯基，腈基流動(dòng)相極性大于固定相，適合分離中小極性的化合物的萃取疏水性相互作用,,正相固相萃取,無(wú)鍵合硅膠、或硅膠上鍵合氰基、NH2、二醇基流動(dòng)相極性小于固定相，適合于極性的化合物的萃取親水性相互作用,,離子交換萃取,硅膠基質(zhì)的離子交換官能團(tuán)，季胺，氨基、二氨基、苯磺酸基、羧基帶

16、有電荷的化合物靠靜電吸引到帶有電荷的吸附劑表面,,吸附型萃取,采用極性較強(qiáng)的硅膠、硅藻土和氧化鋁等吸附劑,固相萃取和HPLC相比的特點(diǎn),SPE也是一個(gè)柱色譜分離過(guò)程，分離機(jī)理、固定相和溶劑的選擇等方面與高效液相色譜（HPLC）有許多相似之處。 但是SPE柱的填料粒徑（>40µm）要比HPLC填料（3~10µm）大。由于短的柱床和大的粒徑，SPE柱效比HPLC色譜柱低得多。 因此，用SP

17、E只能分開保留性質(zhì)有很大差別的化合物。與HPLC的另一個(gè)差別是SPE柱是一次性使用。,固相萃取操作一般有五步：活化——甲醇/乙腈 潤(rùn)濕小柱，活化填料；平衡——水或適當(dāng)緩沖液沖洗平衡小柱；上樣——將樣品轉(zhuǎn)移上柱，抽去廢液；淋洗——水或緩沖液最大程度洗去干擾物；洗脫——用小體積的溶劑將被測(cè)物質(zhì)洗脫下來(lái)并收集。,親脂型鍵合硅膠SPE柱實(shí)驗(yàn)步驟,,,,平衡,上樣,淋洗,洗脫,基質(zhì),雜質(zhì),目標(biāo)化合物,常見的固相萃取柱,普通C18固相萃

18、取固相萃取材料耐受PH范圍窄（2-7.5）硅膠鍵合吸附劑的表面存在未鍵合的硅羥基，對(duì)堿性化合物的保留較強(qiáng)，用硅膠鍵合吸附劑處理堿性化合物，回收率通常較低對(duì)極性化合物保留差,HLB(Hydrophilic-lipophilic Balance Copolymer)PH1-14范圍內(nèi)穩(wěn)定無(wú)裸露的硅醇羥基親水物質(zhì)和親脂物質(zhì)具有均衡的保留能力，覆蓋了非極性、弱極性、極性化合物,,Oasis HLB柱（聚合物基質(zhì)）,親水親脂柱的優(yōu)點(diǎn)

19、親水基團(tuán)（吡咯烷酮基團(tuán)）和疏水基團(tuán)（二乙烯基苯）,對(duì)極性化合物和非極性化合物均有較好的保留，具有親水親脂平衡的特性具有水可潤(rùn)濕性，填料經(jīng)活化后，即使柱床干涸，吸附劑對(duì)目標(biāo)物的保留也不會(huì)發(fā)生變化有機(jī)聚合物而非硅膠，在pH 0-14 的范圍內(nèi)表現(xiàn)穩(wěn)定有機(jī)聚合物基質(zhì)的吸附劑，不存在次級(jí)相互作用，用于堿性化合物能夠得到滿意的結(jié)果,Oasis HLB柱（聚合物基質(zhì)）,Oasis HLB柱（聚合物基質(zhì)）,離子交換與反相模式混合的固相萃取,,

20、強(qiáng)陽(yáng)離子和反相雙重保留基質(zhì)常用于提取凈化生物基質(zhì)中的弱堿性化合物酸性環(huán)境中含氮堿性基團(tuán)與磺酸基結(jié)合酸性藥物呈分子狀態(tài)發(fā)生反相結(jié)合作用,反相作用,離子交換,離子交換與反相模式混合的固相萃取,固相萃取法方法總結(jié),SPE優(yōu)點(diǎn)：1、不發(fā)生乳化；2、適應(yīng)的極性范圍較廣；3、提取效率高；4、方便快速；5、溶劑用量少；6、易于自動(dòng)化；7、室溫下操作，尤其適于處理?yè)]發(fā)性及對(duì)熱不穩(wěn)定的藥物。 目前，商品化固相提取小柱（ca

21、rtridge）的應(yīng)用已比較普遍。,最大的缺點(diǎn)： 貴 20多元/支,三種方法的比較：,樣本較干凈基質(zhì)效應(yīng)低,操作迅速適合各種性質(zhì)化合物,基質(zhì)效應(yīng)及其影響,基質(zhì)效應(yīng)（martix effect）：定義：樣品測(cè)試過(guò)程中，由于待測(cè)物以外的的其它物質(zhì)存在，直接或間接影響待測(cè)物相應(yīng)的現(xiàn)象如測(cè)定血液中的紅霉素濃度為例，除了紅霉素之外的蛋白、磷脂、及其它內(nèi)源性物質(zhì)為基質(zhì)共流成分會(huì)改變待測(cè)化合物的離子化效率，引起對(duì)待測(cè)化合物監(jiān)測(cè)信號(hào)的抑

22、制或提高,基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法,柱后灌注法提取后加入法（相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)）,MF：基質(zhì)效應(yīng)因子MF=Set 2/Set 1IS-normalized MF :內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子,Set 2: 提取空白生物基質(zhì)，濃縮復(fù)溶形成溶液，將待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)加入此溶液中。Set 1: 將待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)溶于非生物基質(zhì)的空白溶液， 如: 用甲醇、 乙腈等溶劑直接配制待測(cè)物或內(nèi)標(biāo)的溶液,基質(zhì)效應(yīng)的消除,（1）選擇合適的樣品預(yù)處理方法蛋白沉淀法 處

23、理后的樣品不是很干凈、內(nèi)源性物質(zhì)較多，從而產(chǎn)生較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)液液提取法和固相萃取法處理后的樣品較潔凈，絕大多數(shù)內(nèi)源性物質(zhì)易被去除，但操作復(fù)雜，可能帶來(lái)提取回收率低其它問題,基質(zhì)效應(yīng)的消除,（2）改變被測(cè)物的色譜分離條件優(yōu)化色譜條件使得待測(cè)物與內(nèi)源性雜質(zhì)分離內(nèi)源性雜質(zhì)一般極性大，反相液相中保留時(shí)間短適當(dāng)延長(zhǎng)待測(cè)組分的保留時(shí)間，有利于減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)測(cè)定的影響,基質(zhì)效應(yīng)的消除,（3）采用性質(zhì)相近或穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)同位素標(biāo)記物為最為理