熒光定量pcr在臨床醫(yī)學中的應用

1、熒光定量PCR在臨床醫(yī)學中的應用,內容提要,一、基因診斷技術簡介二、乙型肝炎的病原檢測三、丙型肝炎的病原檢測四、性病相關病原體的檢測,基因診斷技術簡介,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,4 基因診斷,3 免疫學診斷,臨床診斷,細胞膜,細胞核,DNA,轉錄,mRNA,翻譯,蛋白質,1 形態(tài)學診斷,2 生化診斷,,概念,PCR與基因診斷技術,基因診斷即通過核酸的分子生物學檢測直接檢測基因的存在狀態(tài)或缺陷對疾病

2、作出診斷的方法。Polymerase chain reaction(PCR)，聚合酶鏈式反應，是一種DNA的快速擴增技術。PCR技術通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一種耐熱酶的作用，可在3個小時內把特定的DNA片段擴增1000萬倍。 九十年代中期PCR臨床應用在國內全面開展，1998年，熒光定量PCR技術開始在中國應用于臨床檢測。,熒光定量PCR技術,實時熒光定量PCR技術，是指在反應體系中加入熒光標記，利用熒光信號積累實時檢測

3、整個PCR過程，通過標準曲線對PCR終產(chǎn)物的分析，最終實現(xiàn)對未知的起始模版進行定量分析的一種技術，是迄今對已知基因序列的核酸測定中最靈敏的方法。,熒光染料：SYBR Green I、EVA Green熒光探針：TaqMan、 Hybridization Probes 、Molecular Beacon,熒光定量PCR技術的優(yōu)點,特異性強：直接擴增病原體的特異DNA或異常基因片段靈敏度高：可檢測到極少量的DNA，有效降低漏診率高效省

4、時：擴增周期短，有利于快速診斷取材范圍廣：血清、痰液、體液、毛發(fā)等多種樣本全封閉反應：無需PCR后處理，降低污染定量準確：利用標準曲線法，采用對數(shù)期分析自動化程度高：操作安全，避免人為判斷,RocheLightCycler,,,,,熒光定量PCR技術的臨床應用,病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因檢測性病相關病原體（CT、NG、UU、HPV）的基因檢測優(yōu)生優(yōu)育項目診斷：人巨細胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒

5、II型（HSV）、弓形蟲（TOX）、風疹病毒其它病原體檢測：結核桿菌、肺炎支原體、EB病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等,乙型肝炎的病原檢測,乙肝病毒,,HBV的感染過程,乙肝如何傳染？,慢性HBV感染,病毒持續(xù)6個月未被清除者免疫耐受期：HBV復制活躍免疫清除期非活動或低復制期,慢性乙型肝炎,HBeAg陽性慢性乙型肝炎HBeAg陰性慢性乙型肝炎,乙型肝炎肝硬化,代償期肝硬化失代償期肝硬化,HBsAg與抗HBs,HBsAg

6、在感染HBV兩周后即可陽性。只要HBsAg陽性就可診斷HBV感染，陰性則不能排除HBV感染?？笻Bs為保護性抗體，陽性表示對HBV有免疫力。,HBsAg和抗HBs同時陰性： 即所謂窗口期，此時HBsAg和抗HBs都未產(chǎn)生。HBsAg和抗HBs同時陽性： HBV感染恢復期，此時HBsAg未消失，抗HBs已產(chǎn)生?；蛘呤莵喰透腥?。,為什么HBsAg陰性不能排除HBV感染？,窗口期檢測試劑不夠靈敏隱匿性慢性乙肝（S基因

7、變異）重疊HCV感染（干擾HBsAg合成）,抗HBs陽性就萬無一失了嗎？,單一抗HBs陽性HBV DNA檢出率0-11.8%先后感染了不同的HBV亞型HBV病毒S基因變異,如何診斷血清HBsAg陰性的HBV感染？,提高檢測敏感性采用針對變異抗原的檢測試劑HBV DNA的檢測！,HBeAg與抗HBe,HBeAg的存在表示病毒復制活躍且有較強的傳染性。HBeAg消失而抗HBe產(chǎn)生稱為血清轉換?？笻Be陽轉后，病毒復制水平低，傳

8、染性降低。但長期抗HBe陽性者并不代表病毒復制停止或無傳染性，研究顯示20%～50%仍可檢測到HBV DNA，部分可能由于前C區(qū)基因變異，導致不能形成HBeAg。,HBeAg與抗HBe共存？,處于血清轉換過程中野生株與變異株同時存在,HBeAg水平與HBV DNA的關系,HBeAg陽性標本HBV DNA檢出率90％左右HBeAg與HBV DNA有著良好的相關性,HBeAg陰性/抗HBe陽性/HBV DNA陽性,HBV DNA水

9、平一般較低HBV低水平復制HBV病毒前C區(qū)基因變異重疊HCV感染,“兩對半”缺陷,“兩對半”是機體的免疫反應狀態(tài)，為間接指標?！皵y帶者”、“大三陽”、“小三陽”等免疫學指標不能反應體內病毒復制水平與感染程度。HBsAg陰性或HBeAg陰性不能排除HBV感染。,HBV DNA,是病毒復制和傳染性的直接標志。HBV DNA定量對于判斷病毒復制程度、傳染性大小、病毒藥物療效等有重要意義。,HBV DNA拷貝數(shù)＝乙肝病毒載量,HBV

10、 DNA檢測的臨床意義,HBV DNA是HBV存在最直接的依據(jù)HBV DNA是HBV復制的標志HBV DNA是患者具有傳染性的標志HBV DNA對乙肝兩對半起補充作用HBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標HBV DNA可檢測出隱匿性慢性乙型肝炎,提供直接證據(jù)縮短“窗口期”,有利于獻血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷,HBV DNA檢測的臨床意義,,HBV DNA檢測的臨床意義,調查表明并不是所有“大三陽”的病人

11、都處于HBV復制期，具有傳染性；也不是所有“小三陽”的病人HBV都無復制。因此，要準確知道HBV是否處于復制狀態(tài)，最準確的方法還是通過檢測HBV DNA來決定。,HBV DNA檢測方法,斑點雜交（基本淘汰）定性PCR（基本淘汰）熒光定量PCR（主流）基因芯片（將來？）,為什么建議病人要進行HBV DNA檢測？,熒光定量PCR方法檢測HBV感染的各期,,HBsAg和HBeAg均陽性而HBV DNA陰性？,干擾素或拉米夫定等治療后病

12、毒復制受抑制。PCR所用引物相應的DNA序列發(fā)生突變，此引物與突變DNA不能配對結合。病毒DNA整合于宿主肝細胞染色體而血中游離HBV DNA很少或缺乏。,乙肝的治療,目前尚無一種能迅速、直接殺死清除乙肝病毒的藥物，最好的抗病毒藥物療效也僅能達到50％左右。目前國際醫(yī)學界公認的治療慢性乙肝有確切療效的抗病毒藥物主要有兩大類： ?干擾素：重組人α-1b干擾素、α- 2a、

13、 α-2b干擾素等。 核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋。,乙肝的治療,主要包括抗病毒、免疫調節(jié)、抗炎保肝、抗纖維化等對于HBV DNA≥105的患者應進行抗病毒治療,拉米夫定,可迅速降低HBV DNA的濃度，改善肝臟組織的病變，還可能阻斷肝纖維化的進程，終止肝硬化的發(fā)展。尤其是拉米夫定不受病毒感染的模式、野生型或基因組前C區(qū)突變的影響。此外拉米夫定還能抑制肝移植受體和AIDS病人體內的HBV復制。,拉米夫

14、定治療人群,有明顯HBV DNA復制者前C區(qū)變異的慢性乙型肝炎代償期的慢性乙型肝炎接受肝臟移植的患者干擾素治療失敗,拉米夫定治療效果,絕大多數(shù)患者HBV DNA水平顯著下降。用藥4周開始下降，12至16周約半數(shù)以上的病例血清HBV DNA降到可檢測水平以下。治療1年后HBeAg陰轉率約為20%。,病毒學應答：HBV DNA低于檢測下限血清學應答生化學應答組織學應答,應用抗病毒藥物后如何判斷療效？,應用抗病毒藥物后如何判

15、斷療效？,治療結束時完全應答隨訪1年持續(xù)應答無應答,YMDD變異,YMDD：酪氨酸－蛋氨酸－天門冬氨酸－天 門冬氨酸蛋氨酸（M）突變?yōu)楫惲涟保↖）或纈氨酸（V）形成YIDD變異株或YVDD變異株 。,抗病毒治療中存在的問題,,HBV-YMDD變異檢測的臨床意義,動態(tài)檢測：服用拉米夫定3個月開始，每月 檢測1次提前發(fā)現(xiàn)：可在耐藥臨床表現(xiàn)發(fā)生前1-4個

16、 月檢測出突變株及時調整：適時調整用藥方案，防止因耐 藥而導致病情惡化,丙型肝炎的病原檢測,丙肝病毒,HCV是單鏈RNA病毒主要通過血液和血制品傳播感染后易轉變?yōu)槁愿窝谆虬l(fā)展為肝硬化、肝癌呈全球性分布，約1%普通人群感染,抗HCV IgM和抗HCV IgG,HCV抗體不是保護性抗體，是存在HCV感染的標志?？笻CV IgM在發(fā)病后即可檢測到，一般持續(xù)1

17、～3個月。如果抗HCV IgM持續(xù)陽性，提示病毒持續(xù)復制，易轉為慢性。低滴度抗HCV IgG提示病毒處于靜止狀態(tài)，高滴度提示病毒復制活躍。,HCV抗原檢測的困難,HCV在血液中含量極低，僅為HBV的1%HCV病毒顆粒很難有效地分離純化、人工合成抗原丙型肝炎的窗口期很長，血清學檢測無法早期診斷抗體持續(xù)性存在，無法提示正確的病毒載量HCV的型別復雜，高突變率HCV核心抗原檢測試劑盒敏感性差：45.68%,HCV RNA,HCV

18、 RNA陽性是病毒感染和復制的直接標志。HCV RNA的定量測定有助于了解病毒復制程度、抗病毒治療的選擇及療效評估等。,HCV RNA熒光定量PCR檢測的臨床意義,早期診斷：在免疫學檢測的“窗口期”或一部分不產(chǎn)生抗體的丙肝病毒攜帶者，都可出現(xiàn)HCV RNA陽性，抗HCV陰性的檢測結果。彌補ELISA方法的高漏檢率,HCV RNA可作為HCV感染診斷的指標。HCV RNA定量可指導用藥，為療效觀察及預后判斷提供客觀指標?？笻CV不能作

19、為抗病毒療效的指標。慢性丙型肝炎長期抗HCV陽性，這只表示曾經(jīng)感染了丙肝病毒并出現(xiàn)了相應的免疫應答，并不代表體內仍有丙肝病毒的存在或復制，這時只能通過HCV RNA定量檢測鑒別丙肝病毒的活動性和復制程度。HCV主要通過輸血和血制品傳播，對獻血員及血制品進行檢測，以減少醫(yī)源性丙型肝炎的發(fā)生和傳播。,核酸檢測在HCV感染的診斷中要比HBV感染的診斷重要得多！,性病相關病原體的檢測,性病在我國已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題，自99年以來，性

20、病的發(fā)生率居高不下，其發(fā)病率在傳染性疾病中位居第3位，03年我國累計報道性病病例數(shù)（HIV除外）73萬。浙江省為高發(fā)區(qū)，位居全國第三。,常見性傳播疾病病原體,淋病雙球菌(NG)沙眼衣原體(CT)解脲支原體(UU)人類乳頭瘤病毒(HPV)人類免疫缺陷病毒(HIV),淋病雙球菌的傳統(tǒng)檢測方法,涂片染色：對于女性患者檢出率低，易出現(xiàn)假陰性分離培養(yǎng)：培養(yǎng)較困難，生化鑒定復雜，時間長ELISA抗原檢測法：存在交叉反應，非特異反應較嚴重

21、,熒光定量PCR檢測NG的優(yōu)勢,可在短時間內快速、準確地直接從臨床各種標本中檢出含量極低的病原菌對女性疑似淋球菌引起的各種炎癥的診斷及鑒別診斷起決定性作用對癥狀輕者或無癥狀的淋球菌感染者做到早期診斷和鑒別診斷可用于療效考核,沙眼衣原體,沙眼衣原體感染與致病,近年來在歐美等國，沙眼衣原體的感染率和危害性已超過淋球菌在我國，在非淋球菌性尿道炎中居首位泌尿生殖道感染，妨礙妊娠盆腔感染，可致生殖能力損害,傳統(tǒng)方法檢測沙眼衣原體的缺陷

22、,“窗口期”檢測不出不能判定是現(xiàn)癥感染還是既往感染,熒光定量PCR檢測衣原體的優(yōu)勢,靈敏度98%以上、特異性100%提高陽性檢出率適用于感染的早期診斷和無癥狀攜帶者的檢查,解脲支原體,UU難以分離，需特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)，操作費時，需1-3天才能得到初步結果。血清學檢查，僅10%UU尿道炎患者在病程中特異性抗體滴度升高4倍，使其方法學應用受限。一些非致病的脲原體或培養(yǎng)過程中的污染都可能導致假陽性的結果。,傳統(tǒng)方法檢測解脲支原體的缺

23、陷,具有高度的敏感性和特異性，提高陽性檢出率快速、定量準確，可以為臨床評價療效提供依據(jù),熒光定量PCR檢測支原體的優(yōu)勢,CT、UU是美國FDA批準的PCR檢測試劑盒，作為首選方法，在臨床推廣應用,人類乳頭瘤病毒,有100多個型只能感染人的皮膚和黏膜上皮細胞，人是HPV的惟一宿主免疫原性低，易形成持續(xù)性感染新生兒產(chǎn)道感染,HPV,,傳統(tǒng)巴氏涂片漏診率可達30%從細胞學水平來觀察細胞的形態(tài)學改變，其中80%的患者確診時已是宮頸癌

24、晚期,傳統(tǒng)方法檢測HPV的缺陷,早期感染的病原檢測可對HPV進行分型可以評估病毒載量與患癌癥風險可以考核療效與預后用于HPV感染與生殖器腫瘤相關性的研究,熒光定量PCR檢測HPV的優(yōu)勢,人類免疫缺陷病毒,是引起艾滋病的病原體,可判定無癥狀且血清陰性患者潛在的HIV傳播性檢測長潛伏期的HIV攜帶者使“窗口期”縮短10天在治療過程中觀察患者血清HIV載量的變化預示病情的轉歸和指導臨床用藥對于新生兒是否從母體感染HIV的診斷尤

25、為適用,熒光定量PCR檢測HIV,小結,熒光定量PCR是特異、靈敏、高效的基因診斷技術對致病微生物核酸含量進行定量檢測彌補免疫檢測的缺陷（如HCV）縮短診斷的窗口期（如HIV），利于早期診斷,對治療過程進行療效監(jiān)測指導用藥過程及劑量，以制定合理的療效方案定量PCR的臨床應用可結合臨床表現(xiàn)，并與傳統(tǒng)的免疫學、影像學等診斷方法來綜合評判，更為科學,小結,04年6月，衛(wèi)生部臨檢中心主任申子瑜、中國醫(yī)科大學附屬一院副院長尚紅等專家對迪