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1、各期梅毒實(shí)驗(yàn)診斷方法,廣東省皮膚病醫(yī)院廣東省皮膚性病防治中心鄭和平 PhD,“廣東瘡”,,廣東與全國(guó)梅毒比較1995-2011(incidence/100,000),,1995-2011年廣東省各期梅毒發(fā)病情況,GD STD LG Yang,2011年,全省21個(gè)地市報(bào)告梅毒51,051例,報(bào)告數(shù)占全國(guó)報(bào)告總數(shù)的11.88%,位居全國(guó)第一,梅毒診斷的準(zhǔn)確性如何?,某省疾控中心共核查后天梅毒164例,其中,未做RPR定性的43例,
2、未進(jìn)行RPR定量的64例,根據(jù)臨床表現(xiàn)但無(wú)癥狀記錄的92例。核實(shí)7例先天梅毒均不符合國(guó)家確診標(biāo)準(zhǔn)。 診斷技術(shù)的掌握和正確應(yīng)用很重要,先天梅毒血清學(xué)的隨訪研究5年上海市99例報(bào)道先天梅毒患兒 TPPA隨訪 轉(zhuǎn)陰率 累計(jì)陰轉(zhuǎn)率 1個(gè)月 1.14% 1.14% 3個(gè)月 17.65% 18.59% 6個(gè)月 39.91% 44.5
3、7% 12個(gè)月 40% 66.74% 18-24月 23.08% 74.42%[1]顧偉鳴等,先天梅毒的血清學(xué)隨訪,中華傳染病雜志 2007,25(2):117-119 誤診率???? 檢測(cè)能力差!!,梅毒診斷的準(zhǔn)確性如何?,2011年梅毒診斷試劑臨床評(píng)估結(jié)果,中國(guó)性病控制中心,廣西皮膚病防治研究所、北京市CDC、云南省CD
4、C、甘肅省CDC、浙江省皮膚病防治研究所等,《中國(guó)預(yù)防與控制梅毒規(guī)劃 (2010-2020年)》,加強(qiáng)梅毒檢測(cè)質(zhì)量控制和實(shí)驗(yàn)室能力建設(shè),充分利用現(xiàn)有資源,開(kāi)展梅毒檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量考評(píng)和技術(shù)指導(dǎo),提高梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的準(zhǔn)確性和梅毒確證檢測(cè)的可及性”,各期梅毒實(shí)驗(yàn)診斷方法,,未經(jīng)治療的梅毒病人的自然病程,,,,感染梅毒螺旋體,一期梅毒,二期梅毒,潛伏梅毒,三期梅毒,72%,30%,終生潛伏梅毒,,,,,,中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染,,28%,
5、感染梅毒螺旋體,2-6周,1-3月,1-3月,2-50年,,,,[2]Gjestland, T. 1955. The Oslo study of untreated syphilis; an epidemiologic investigation of the natural course of the syphilitic infection based upon a re-study of the Boeck-Bruusgaard
6、material. Acta Derm. Venereol. 35:3–368; Annex I-LVI.,一期梅毒的臨床表現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)室診斷,入侵部位,,臨床表現(xiàn),廣東省皮膚性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,致病性螺旋體,一,梅毒病原學(xué)檢測(cè),1,病原學(xué)檢測(cè):1)暗示野鏡檢:方法:滲出液混于鹽水中,暗示野鏡觀察結(jié)果:可見(jiàn)典型梅毒螺旋體和特殊運(yùn)動(dòng)方式,[5]R. Heymans, et al. J. CLIN. MICR
7、OBIOL.2010 48(2):497,2)暗示野與PCR檢測(cè). [5] Clinical Value of Treponema pallidum Real-Time PCR for Diagnosis of Syphilis,[6]Molecular Characterization of Syphilis in Patients in Canada: Detection of Treponema pallidum DNA in
8、 Whole-Blood Samples versus Ulcerative Swabs J. CLIN. MICROBIOL. 2009,47(6):1668,病人87例:41梅毒(19例一期,9例二期,10例潛伏,3例先天)靶基因:T. pallidum tpp47, bmp, polA,23S rRNA gene結(jié)果:結(jié)論:潰瘍拭子樣本適合于一期梅毒的PCR檢測(cè) 二期血液樣本中50%活動(dòng)性梅毒可
9、檢測(cè)到TP-DNA,WHO推薦暗示野鏡檢診斷早期梅毒,早于抗體出現(xiàn)前數(shù)日至數(shù)周 organisms/mL required for visualization 敏感性80%,但陰性不能排除梅毒[3]Larsen S, et al. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin Microbiol Rev 1995;8:1–21.假
10、陽(yáng)性:與口腔肛周其他螺旋體相似,不推薦口腔肛周標(biāo)本[4]Tramont E. Syphilis in adults: from Christopher Columbus to Sir Alexander Fleming to AIDS. Clin Infect Dis 1995;21:1361–71PCR敏感性特異性高.適宜早期診斷。,病原體檢測(cè),二、血清學(xué)檢查非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn) VDRL、USR、RPR、TRUST
11、2. 梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn) FTA-ABS、TPHA、 TPPA、ELISA、TP-RT IgM,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn):原理:梅毒螺旋體破壞宿主細(xì)胞釋放以及其螺旋體細(xì)胞表面釋放的類(lèi)脂物質(zhì),刺激機(jī)體產(chǎn)生抗類(lèi)脂抗體(反應(yīng)素)。在體外該抗體與心磷脂、卵磷脂和膽固醇組成的抗原反應(yīng),形成凝集反應(yīng)。方法:VDRL (venereal disease research laboratory test)
12、 USR (unheated serum reagin test) RPR (rapid plasma reagin circle card test) TRUST (tolulized red unheated serum test)特點(diǎn):非特異性反應(yīng),,,,2、梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn),原理:基于TP特異性抗原,檢測(cè)TP抗體方法:凝集法:TPHA, TPPAFTA
13、-ABSELISA19sIgMTP-RT(膠體金法),,,[19]S Ratnam. The laboratory diagnosis of syphilis. Can J InfectDis Med Microbiol 2005;16(1):45-51.,1)TPPA/TPHA原理:超聲裂解TP抗原或基因工程抗原,致敏明膠顆粒/家禽RBC,與血清中抗TP抗體結(jié)合,發(fā)生凝集反應(yīng)。臨床:梅毒確證注意存在交叉(1:80)
14、低滴定時(shí)候,F(xiàn)TA-ABS確證,2)FTA-ABS(fluoresent treponemal antibody absorption test)原理:血清經(jīng)吸收劑(Reiter)去非特異性抗體,與TP反應(yīng),形成Ab+Ag復(fù)合物;再加TITC標(biāo)記的抗人IgG/IgM抗體,形成熒光復(fù)合物,熒光鏡下,TP呈蘋(píng)果綠色熒光。臨床:最可靠確證試驗(yàn)特點(diǎn):高度特異,,3)ELISA:原理:TP特異性抗原包備酶標(biāo)板,與血清中TP抗體結(jié)合,加入
15、酶標(biāo)抗體,底物顯色。臨床:用于梅毒篩查。注意: 高敏感性,特異較差。,4) 19sIgM:原理:ELISA, WB等臨床:早期梅毒診斷 先天梅毒診斷,,5)TP-RT膠體金法:原理(見(jiàn)圖)臨床:篩查注意: 高敏感性,特異較差。,[11]Reactivity of Microhemagglutination, Fluorescent Treponemal Antibody bsor
16、ption, and Venereal Disease Research Laboratory Tests in Primary Syphilis,[11] JOHN D. DYCKMAN, J. CLIN. MICROBIOL. 1980,12(4):629,VDRL、FTA-ABS、TPHA關(guān)系,,[12]S Ratnam. The laboratory diagnosis of syphilis. Can J InfectDis
17、Med Microbiol 2005;16(1):45-51.,梅毒螺旋體血清學(xué)檢測(cè)用試劑的敏感性和特異性 2011年國(guó)家公布,一期梅毒血清學(xué)非梅毒螺旋體抗體常為陰性或弱陽(yáng)性(<1:8)梅毒螺旋體抗體常為陰性或弱陽(yáng)性(<1:320)單次陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)結(jié)合臨床病史慎重診斷,陰性并不能排除梅毒,需連續(xù)觀察抗體滴度↑。IgM抗體早于IgG抗體,常為陽(yáng)性反應(yīng)[18]Baughn, R. E., and R. F. Sche
18、ll. 2001. Immune responses to Treponema pallidum and Borrelia burgdorefi, p. 27.1–27.7. In R. R. Rich (ed.), Principles and practice of clinical immunology, 2nd ed. Mosby, St. Louis, Mo.,二,梅毒血清學(xué)篩查策略:,梅毒篩查策略 IRPR/TRUST陽(yáng)性
19、 TPPA/FTA陽(yáng)性 梅毒特點(diǎn):傳統(tǒng)方法,漏檢高(15%),現(xiàn)癥。,,,梅毒篩查策略 II:,TP-ELISA陽(yáng)性 TPPA陽(yáng)性確證(陽(yáng)性) TRUST陽(yáng)性
20、 梅毒 特點(diǎn):批量檢測(cè),敏感性高 ,需現(xiàn)癥鑒別,,,,梅毒篩查策略 III:,TP-RT陽(yáng)性 TPPA陽(yáng)性確證(陽(yáng)性) TRUST陽(yáng)性 梅毒 特點(diǎn):簡(jiǎn)便快速,敏感性高 ,需現(xiàn)癥鑒別,,,,互為確證試驗(yàn),RPR陽(yáng)性 TPPA陽(yáng)
21、性 梅毒TPPA陽(yáng)性 RPR陽(yáng)性 梅毒 梅毒確診,,,,,,,,一期梅毒血清學(xué)非梅毒螺旋體抗體常為陰性或弱陽(yáng)性(<1:8)梅毒螺旋體抗體常為陰性或弱陽(yáng)性(<1:320)單次陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)結(jié)合臨床病史慎重診斷,陰性并不能排除梅毒,需連續(xù)觀察抗體滴度↑。IgM抗體早于IgG
22、抗體,常為陽(yáng)性反應(yīng)[18]Baughn, R. E., and R. F. Schell. 2001. Immune responses to Treponema pallidum and Borrelia burgdorefi, p. 27.1–27.7. In R. R. Rich (ed.), Principles and practice of clinical immunology, 2nd ed. Mosby, St.
23、Louis, Mo.,,二期梅毒的臨床表現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)室診斷,臨床表現(xiàn),,,,,,,,,,[12]S Ratnam. The laboratory diagnosis of syphilis. Can J InfectDis Med Microbiol 2005;16(1):45-51.,非梅毒螺旋體抗體100%陽(yáng)性,且滴度>1:32梅毒螺旋體抗體100%敏感性與98%特異性,且滴度>640,大量抗體的產(chǎn)生可能導(dǎo)致前帶現(xiàn)象。
24、皮損暗視野檢測(cè)絕大多數(shù)可檢測(cè)到螺旋體,但由于血清學(xué)方法的簡(jiǎn)單性,而檢測(cè)較少。[20]Robert E. Baughn and Daniel M. Musher. Secondary Syphilitic Lesions CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, 2005, 205–216,二期梅毒,三期梅毒的臨床表現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)室診斷,,臨床表現(xiàn),,,晚期,,[12]S Ratnam. The laboratory
25、diagnosis of syphilis. Can J InfectDis Med Microbiol 2005;16(1):45-51.,三期梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷,晚期梅毒的皮損中,極難找到TP。非梅毒螺旋體抗體71%陽(yáng)性,梅毒螺旋體抗體96%陽(yáng)性。腦脊液WBC、蛋白、VDRL陽(yáng)性。,廣東省皮膚性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,未治療早期梅毒孕婦的胎兒感染率75-95%,四、先天梅毒的臨床表現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)室診斷,廣東省皮膚性病防
26、治中心 WWW.GDVDC.COM,孕婦梅毒的后果,約8%<37周早產(chǎn)約11%低體重兒約5%為產(chǎn)期死亡約4%胎兒死亡約1.5%新生兒死亡約2%先天畸形,廣東省皮膚性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,先天梅毒分期,早期先天性梅毒:2歲以內(nèi)晚期先天性梅毒:2歲以上,臨床表現(xiàn),,,,廣東省皮膚性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,孕婦梅毒的篩查---預(yù)防和發(fā)現(xiàn)先天梅毒的關(guān)鍵,孕婦梅毒篩查:妊娠期或分娩時(shí)至少
27、做一次梅毒血清學(xué)試驗(yàn)。,28% of positive RPR in pregnant women are biological false positives. [21]Tosanna W. Peeling and Htun Ye. Diagnostic tools for preventing and managing maternal and congenital syphilis: an overview. Bulletin
28、of the WHO 2004 82(6):438,廣東省皮膚性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,先天梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷,WHO和美國(guó)CDC推薦應(yīng)符合四項(xiàng)之一: ①在新生兒體內(nèi)查到梅毒螺旋體; ②抗心磷脂抗體滴度持續(xù)上升; ③出生時(shí)患兒抗心磷脂抗體滴度高于其母親4倍 ④檢測(cè)抗梅毒的IgM特異性抗體陽(yáng)性。 [22]Saloojee H, et al. The prevention and
29、management of congenital syphilis: an overview and recommendations. Bull World Health Organ, 2004, 82:424-430. [23]Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Congenital syphilis-United States, 2002. MMWR Morb Mor
30、tal Wkly Rep. 2004,53:716-719.,1. 病原體檢測(cè):1)暗示野檢查:Darkfield examinations of amniotic fluid obtained by amniocentesis have been shown to be of value in the diagnosis of congenital syphilis5例發(fā)生死胎的未治療梅毒孕婦羊水暗示野檢查100%可見(jiàn)螺旋
31、體活檢組織中2/5鍍銀染色陽(yáng)性。 [24]Wendel G, Maberry M, Christmas J, et al. Examination of amniotic fluid in diagnosing congenital syphilis with fetal death. ObstetGynecol 1989;74:967–70.,2)PCR檢測(cè)TP,[25]Use of Polymerase Chain Reac
32、tion and Rabbit Infectivity Testing To Detect Treponema pallidum in Amniotic Fluid, Fetal and Neonatal Sera, and Cerebrospinal FluidGRIMPREL E, et al.. J. CLIN. MICROBIOL.1991, 29:1711,然而:許多先天梅毒患兒出生時(shí)通常無(wú)臨床癥狀。&l
33、t;15月的新生兒由于母親抗體的被動(dòng)轉(zhuǎn)移而至IgG檢測(cè)無(wú)法鑒別先天梅毒。通常新生兒RPR滴度大于母親4倍時(shí)強(qiáng)烈支持先天梅毒。但研究發(fā)現(xiàn)<30%先天梅毒患兒RPR滴度如此。 [26]Rawstron SA,et al. congenital syphilis and fluorescent treponemal antibody test reactivity
34、 after the age of 1 year. Sexually Transmitted Diseases 2001; 28:412,3)血清TP-IgM檢測(cè),,[28] Evaluation of Immunoglobulin M Western Blot Analysis in the Diagnosis of Congenital Syphilis,results indicate that this techniqu
35、e can be used to identify both symptomatic (92%)and asymptomatic (92%) infection in infants with T. pallidum。特異性100%。,LEWIS LL, J. CLIN. MICROBIOL. 1990,28:296,IgM檢測(cè),在診斷先天梅毒時(shí)有重要的意義, 但早期的治療可使新生兒IgM消退, 故IgM陰性不能排
36、除先天梅毒。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn):最新加入隨訪18個(gè)月TPPA陽(yáng)性者為先天梅毒。先天梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷需要結(jié)合臨床綜合分析,五、神經(jīng)梅毒,早期梅毒常常累及中樞神經(jīng)系統(tǒng),CSF異常改變通常是短暫的,但一些未治療的患者可持續(xù)性異常。[31] Hunter, EF, et al. 1982. Sodium desoxycholate extracted treponemal antigen in an enzyme-linked immun
37、osorbent assay for syphilis. J. Clin. Microbiol. 16:483-486晚期神經(jīng)梅毒占梅毒患者10%,多在感染后3-20年發(fā)病。晚期神經(jīng)梅毒代表著早期梅毒侵犯的繼續(xù)。引起腦(脊)膜血管,神經(jīng)實(shí)質(zhì)(神經(jīng)細(xì)胞及其突起和神經(jīng)膠質(zhì)等損害。,廣東省皮膚性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,神經(jīng)梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷:腦脊液常規(guī)檢查:腦脊液VDRL試驗(yàn):鞘內(nèi)IgM、IgG測(cè)定:腦脊液中梅
38、毒螺旋體檢測(cè)腦脊液特異性IgM測(cè)定:,廣東省皮膚性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,1、腦脊液檢查: WBC>5個(gè)/mm3,總蛋白>400mg/L.表明CSF炎癥 可能為活動(dòng)性神經(jīng)梅毒,判斷療效:WBC降低2、腦脊液VDRL試驗(yàn): CSF標(biāo)準(zhǔn)血清學(xué)試驗(yàn)。 特異性強(qiáng),敏感性較低。 陽(yáng)性時(shí)考慮神經(jīng)梅毒,但有假陰性。sensitivity was 50%? and specificity 9
39、0.6% using positive CSF-VDRL as the gold standard for neurosyphilis. Sensitivity was 61.5% and specificity was 83.6% using both the CSF-VDRL and CSF-WBC criteria,,[32]Cerebrospinal fluid treponemal antibodies in untreat
40、ed early syphilis,1. 39 cases,其中15 HIV 陽(yáng)性.2. 測(cè)定:CSF-WBC,蛋白, VDRL,TPHA,F(xiàn)TA-ABS,白蛋白比例,IgG index.3.結(jié)果:4. 結(jié)論:VDRL CSF treponemal tests may help to exclude a diagnosis of neurosyphilis in patients with early syphilis.
41、,Marra CM, et al. Arch Neurol. 1995 Jan;52(1):68-72.,[33]Clinical significance of cerebrospinal fluid tests for neurosyphilis.,1665例CSF,1978-1987年間.FTA-ABS檢測(cè)48例陽(yáng)性,其中15例診斷神經(jīng)梅毒。VDRL檢測(cè)4例陽(yáng)性,VDRL特異性100%,但敏感性27%。FTA-ABS敏感性
42、高,但特異性差無(wú)法區(qū)別活動(dòng)性神經(jīng)梅毒與以往梅毒。,Davis LE, et al. Ann Neurol, 1989,25:50,廣東省皮膚性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,3,鞘內(nèi)IgG測(cè)定:鑒別鞘內(nèi)生成或源自血清? 活動(dòng)性神經(jīng)梅毒時(shí),CSF的梅毒IgG抗體增高1,白蛋白系數(shù)=CSF白蛋白/血清白蛋白。 判斷血腦屏障功能,正常為0.008-0.0074 2,IgG指數(shù)= CSF總IgG x血清白蛋
43、白 血清總IgG x CSF白蛋白 >0.7時(shí)表示鞘內(nèi)生成IgG。,,廣東省皮膚性病防治中心 WWW.GDVDC.COM,4,鞘內(nèi)TP特異性IgG生成判斷;1)TPHA指數(shù)=CSFTPHA滴度/白蛋白系數(shù)X103 500表明鞘內(nèi)生成TP特異性IgG和活動(dòng)性神經(jīng)梅毒2)改良TPHA指數(shù)=CSFTPHA滴度/血清TPHA滴度
44、 白蛋白系數(shù) 2神經(jīng)梅毒。3)鞘內(nèi)TP抗體= CSFTPHA滴度X血清IgG 血清TPHA滴度XCSF總IgG 0.5-2為正常;>2活動(dòng)性神經(jīng)梅毒。,,,[36]Significance of laboratory findings for the diagnosis of neurosyphilis.,45神經(jīng)梅毒,67例對(duì)照病例。,Luger AF, et al. Int J S
45、TD AIDS. 2000 Apr;11(4):224-34.,CSF-IgM測(cè)定[37]Detection of Immunoglobulin M in Cerebrospinal Fluid from Syphilis Patients by ELISA.,,LEE JB,et al. CLIN. MICROBIOL.1986,24:736,CSF-IgM測(cè)定[37]Detection of Immunoglobulin M i
46、n Cerebrospinal Fluid from Syphilis Patients by ELISA.,特異性:98% test specificity,LEE JB,et al.Detection of Immunoglobulin M in Cerebrospinal Fluid from Syphilis Patients by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. CLIN. MICROBI
47、OL.1986,24:736,6.PCR檢測(cè)腦脊液TP,29例有癥狀和無(wú)癥狀神經(jīng)梅毒CSFPCR檢測(cè):治療前、治療中、治療后結(jié)果:治療前7例急性患者中5例陽(yáng)性,4例慢性患者均陰性,16例無(wú)癥狀神經(jīng)梅毒中2例陽(yáng)性,不幸的是,DNA檢測(cè)在治療中和治療后3年仍為陽(yáng)性。NOORDHOEK JT,et al.. CLIN. MICROBIOL. 1991, 29:1976,[39] Detection by Polymerase Chai
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