基因工程基本過程

1、基因工程基本過程基因工程基本過程基因工程基因工程（geicengineering），也叫基因操作、遺傳工程，或重組體DNA技術。它是一項將生物的某個基因通過基因載體運送到另一種生物的活性細胞中，并使之無性繁殖（稱之為“克隆“）和行使正常功能（稱之為“表達“），從而創(chuàng)造生物新品種或新物種的遺傳學技術。一般說來，基因工程是專指用生物化學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工合成的DNA片段）與載體系

2、統(tǒng)（病毒、細菌質?；蚴删w）的DNA結合成一個復制子。這樣形成的雜合分子可以在復制子所在的宿主生物或細胞中復制，繼而通過轉化或轉染宿主細胞、生長和篩選轉化子，無性繁殖使之成為克隆。然后直接利用轉化子，或者將克隆的分子自轉化子分離后再導入適當的表達體系，使重組基因在細胞內表達，產生特定的基因產物。常用的工具酶工具酶限制性內切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸聚合酶

3、—用于DNA和RNA的合成核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類用于生物細胞的破壁、轉化、核酸純化、檢測等。主要過程有為四步：1獲得目的基因獲得目的基因有多種方法可獲得目得基因1.構建cDNA文庫分離目的基因過程：（1）從真核細胞中提取mRNA，以其為模板，在反轉錄酶的作用下合成cDNA的第一條鏈。（2）以第一條鏈為模板，以反轉錄酶或DNA聚合酶Ｉ作用下合成cDNA的第二條鏈。（3）

4、在甲基化酶作用下使cDNA甲基化。在pH值12.0～12.5范圍內時，線性的DNA會被變性而共價閉合環(huán)狀質粒DNA卻不會被變性。通過冷卻或恢復中性pH值使之復性，線性染色體形成網狀結構，而cccDNA可以準確迅速復性，通過離心去除線性染色體，獲得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，獲得質粒DNA。三構建基因表達載體三構建基因表達載體1.用一定的限制酶切割質粒，使其出現一個切口，露出粘性末端。2.用同一種限制酶切斷目的基因，使其產生

5、相同的黏性末端。3.將切下的目的基因片段插入質粒的切口處，再加入適量DNA連接酶，形成了一個重組DNA分子（重組質粒）。四目的基因導入受體細胞四目的基因導入受體細胞1.將目的基因導入植物細胞－農桿菌轉化法2.將目的基因導入動物細胞－顯微注射法3.將目的基因導入微生物細胞（以大腸桿菌為例）（1）用Ca2處理細胞以增大細菌細胞壁的通透性使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)這種細胞稱為感受態(tài)細胞.（2）將重組表達載體DNA分子溶

6、于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子完成轉化過程.（3）目的基因在受體細胞內，隨其繁殖而復制，由于細菌繁殖的速度非?？欤诤芏痰臅r間內就能獲得大量的目的基因。五目的基因的檢測與鑒定五目的基因的檢測與鑒定1.要檢測目的基因是否插入轉基因生物染色體的DNA上檢測方法：采用DNA分子雜交技術2.檢測目的基因是否轉錄了mRNA檢測方法：同樣用分子雜交技術DNA與RNA雜交3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質檢測方法：