第四講常用分子克隆工具酶簡介

1、常用工具酶簡介,第一節(jié)DNA連接酶(DNA ligase),,1 DNA Ligase1.1 概念1.2 分類 根據(jù)連接反應(yīng)時所需能量輔助因子的不同： 依賴ATP的DNA ligase 依賴NAD+的DNA ligase,,按照來源分： T4噬菌體DNA ligase 大腸桿菌DNA ligase 熱穩(wěn)定DNA ligase,2 DNA ligase簡介2.1 T

2、4 DNA ligase 連接類型： DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA dsDNA的黏性末端和平末端,2.2 大腸桿菌 DNA ligase dsDNA的黏性末端和平末端,,3 DNA ligase 催化連接反應(yīng)的特點3.1 需要3-OH 和5-P3.2 需要ATP或NAD+和Mg2+為輔助因子和激活因子3.3 被連接

3、的是dsDNA3.4 只能封閉缺口,,4 影響DNA ligase 連接反應(yīng)的因素4.1 溫度 黏性末端 4-15℃ 平末端 10-20℃4.2 連接酶濃度 平末端 1-2個單位 黏性末端 0.1個單位,,4.3 ATP濃度4.4 DNA片段末端,,第二節(jié) DNA 聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶,,DNA 聚合酶：

4、在引物和模板的存在下，把脫氧核糖單核苷酸連續(xù)地加到雙鏈DNA分子引物鏈的3′-OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。,1 DNA polymerase分類,依賴于DNA的DNA聚合酶: Ecoli DNA polymerase I klenow片段 T4 phage DNA ploymerase T7 phage DNA plo

5、ymerase 耐熱DNA聚合酶(Taq 酶)依賴于RNA的DNA聚合酶: 反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase),1.1 Ecoli DNA polymerase I 分類： DNA pol I DNA pol Ⅱ DNA pol Ⅲ,,DNA pol I特性：⑴ 5‘-3’DNA聚合酶活性⑵ 3‘-5’外切酶

6、活性⑶ 5‘-3’外切酶活性 （切口平移）,1.2 Klenow片段 大腸桿菌DNA聚合酶I的枯草桿菌蛋白酶水解產(chǎn)物?；钚裕?’ ? 3’聚合酶 3’ ? 5’外切酶,用途： ⑴ 3’-末端補(bǔ)平 ⑵ 3’-末端抹平 ⑶ cDNA第二鏈合成 ⑷ 雙脫氧系統(tǒng)測序,3’-末端補(bǔ)齊 3’-末端標(biāo)記5’-ACGTTGCAAACTG-3’ 3’-TGCAACGTTTGAC…..5’ cDNA第

7、二鏈合成 mRNA 3’-UGCAACGUUUGAC…..5’ c DNA 5’-ACGTTGCAAACTG GAC,,,,,,,,,,,,,5’,3’,5’,3’,5’,5’,5’,5’,5’,5’,3’,3’,3’,3’,3’,3’,熱變性,隨機(jī)引物退火,?-32PdNTP Klenow 酶,~~ 5’,

8、5’~~,5’~~-------,---------~~ 5’,~~ ~~ ~~ ~~ ~~ ~~ ~~ ~~ ~~ ~~ ~~ ~~,1.3 T4 DNA polymerase 特點： 5’→3’聚合酶活性 3’→5’外切酶活性,,用途：⑴補(bǔ)平反應(yīng)⑵末端標(biāo)記⑶抹平反應(yīng),1.4 Taq DNA polymerase 特點： 分離自水生棲熱菌，

9、分子量為94,000，最適反應(yīng)溫度75-80℃ 。 5’-3’聚合酶活性 5‘-3’外切酶活性 用途： 主要用于DNA的體外擴(kuò)增,Taq Pol 和PCR,1.5 反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcripase) 用途： ⑴ cDNA第一鏈的合成 ⑵補(bǔ)平反應(yīng) ⑶用于DNA測序,,第三節(jié)

10、 DNA修飾酶,1.1 末端轉(zhuǎn)移酶（TdT） ⑴ 反應(yīng)特點 在酶的催化下將dNTP加到DNA分子的3‘OH末端，催化作用不需要模板。 ⑵ 用途 3’-加尾，便于兩DNA分子重組 3’-末端標(biāo)記,1.2 T4 多聚核苷酸激酶 催化反應(yīng)： 正向反應(yīng) 催化5‘-OH末端的磷酸化

11、 交換反應(yīng),1.2 T4 多聚核苷酸激酶 用途： 1) DNA或RNA的5’末端標(biāo)記 2) 分子克隆過程中以獲得5’-磷酸基末端，便于連接酶反應(yīng),1.3 堿性磷酸酶 用途 1) 載體DNA的去磷酸化，防止自我連接，以增加重組頻率 2) 5’端 核酸末端標(biāo)記,堿性磷酸酶與T4 多聚核

12、苷酸激酶活性,,第四節(jié) 外切核酸酶,,1 外切核酸酶概念2 分類 按照酶對底物二級結(jié)構(gòu)的專一性，分為： 作用于單鏈的外切核酸酶 作用于雙鏈的外切核酸酶,,第五節(jié)單鏈內(nèi)切核酸酶,1.1 S1核酸酶 特點： ss-DNA; ss-RNA; 雙螺旋變性區(qū) 用途 1) 基因突變--缺失，常與外切酶，如ExoIII、λ外切

13、酶、Bal31連用 2) DNA定序分析 3) S1作圖法 4) 基因結(jié)構(gòu)分析 5) tRNA結(jié)構(gòu)分析,,S1核酸酶活性,,1.2 Bal 31 核酸酶 對單鏈DNA具有特異的內(nèi)切酶活性，可從3‘OH端降解DNA。對于L-DNA，它表現(xiàn)3’-5‘的外切酶活性和5’-3‘的外切酶活性，可又有控制地從3’端和5‘端逐個水解除去單核苷酸，產(chǎn)生縮短了的DNA分子。,1.3

14、 DNase I 用途 1) 切口移位，制備DNA探針 2) 制備RNA樣品時除去DNA分子 3) 基因突變時產(chǎn)生切口,ds-DNA結(jié)構(gòu): 切口, 缺口, 斷口,,,第六節(jié) RNA酶,1.1 RNase,用途： ⑴ 在DNA制備時用于降解RNA分子 ⑵ 去除DNA:RNA 或RNA:RNA中沒有雜合的 RNA區(qū)域,1.2 RNase H

15、,特異地降解DNA:RNA雜合鏈中的RNA部分，產(chǎn)生不同長度的具有3’OH和5‘P端的寡核苷酸，它不能降解單鏈或雙鏈的DNA（或RNA).,切平反應(yīng)和補(bǔ)平反應(yīng),四種不同補(bǔ)平反應(yīng),5’-GGATCC-3’ BamHI 5’-G GATCC-3’3’-CCTAGG-5’ 3’-CCTAG G-5’

16、 dNTP dGTP dGTP/dATP dGTP/dATP/dTTP5’-GGATC 5’-GG 5’-GGA 5’-GGAT 3’-CCTAG 3’-CCTAG 3’-CCTAG 3’-C

17、CTAG GATCC-3’ GATCC-3’ GATCC-3’ GATCC-3’ CTAGG-5’ GG-5’ AGG-5’ TAGG-5’ I S1 S1

18、 S1 5’-GG CC-3’ 5’-GGA TCC-3’ 5’-GGAT ATCC-3’ 3’-CC GG-5’ 3’-CCT AGG-5’ 3’-CCTA TAGG-5’ II