mbp-1分子真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在食管癌細(xì)胞株eca109

1、聯(lián)系電話：（手機(jī)號）基金項(xiàng)目：四川省青年科技基金項(xiàng)目（08ZQ026081）作者簡介：李雪婷（1974），女，四川南充人，碩士研究生，講師，主要從事食管癌基研究。Email:lixueting@△通訊作者：謝勇恩（1967），男，四川南充人，博士，教授，主要從事食管癌研究。Email:xyeeen@收稿日期：20120208(編輯部填寫)說明：作者對本刊投稿，請一律參照本刊《投稿須知》、或近期已發(fā)表文章格式、或以下范文格式修改后發(fā)送電子

2、檔。本刊其他特殊要求：1.參考文獻(xiàn)一般需要12條及以上，盡量引用本刊文獻(xiàn)，并盡量引用近兩年本文文獻(xiàn)12條；2.熱烈歡迎各類基金課題稿件，對廳局級及以上課題論文優(yōu)先發(fā)表。MBP1分子真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在食管癌細(xì)胞株分子真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在食管癌細(xì)胞株Eca109中的高表達(dá)中的高表達(dá)李雪婷，謝勇恩△(川北醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，四川南充637007)【摘要】目的目的：初步探討MBP1的分子功能。方法方法：通過PCR擴(kuò)增獲得MBP1基

3、因編碼序列，將其定向插入質(zhì)粒pcDNA3.1()構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1mbp1，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的食管癌Eca109細(xì)胞株，Westernblotting檢測MBP1在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果結(jié)果：篩選出分子量較大的重組質(zhì)粒，酶切分析和DNA測序分析證實(shí)重組質(zhì)粒含MBP1基因完整編碼序列，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染食管癌Eca109細(xì)胞株后呈現(xiàn)高表達(dá)，其表達(dá)量約為對照細(xì)胞的2.1倍。結(jié)論結(jié)論：成功構(gòu)建了MBP1分子真核表達(dá)載體并在食管癌細(xì)胞

4、中實(shí)現(xiàn)了高表達(dá)，為進(jìn)一步深入研究MBP1的分子功能奠定了基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞】MBP1；真核表達(dá)載體；食管癌細(xì)胞ConstructionoftheeukaryoticexpressingvectfMBP1itsexpressioninesophagealcancercellsLIXuetingXIEYongen(DepartmentofPathophysiologyNthSichuanMedicalCollegeNanchong6370

5、07SichuanChina)【Abstract】Objective:TopreliminarilystudythemolecularfunctionofMBP1雙丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨、硝酸纖維素膜、鼠抗MBP1單克隆抗體、兔抗βactin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，DAB顯色試劑盒均購自晶美生物公司，其余試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。1.3MBP1基因的擴(kuò)增基因的擴(kuò)增根據(jù)GenB

6、ank中MBP1基因序列（GenBankaccessionnumber：GU170215）設(shè)計(jì)一對PCR引物，上游引物序列為：5gcaagcttatggatggaacagaaaataaatctaag3，下游引物為：5gcggatccttacttggccaaggggtttctgaag3，上下游引物分別引入HindⅢ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。引物由大連寶生物科技有限公司合成。以質(zhì)粒pCMV6XLM為模板建立擴(kuò)增體系，循環(huán)參數(shù)為：先94℃

7、預(yù)變性3min，然后進(jìn)入循環(huán)，94℃變性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)自動延伸7min，擴(kuò)增完畢后取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測并對目的條帶進(jìn)行膠回收純化。1.4重組質(zhì)粒的構(gòu)建重組質(zhì)粒的構(gòu)建將MBP1基因片段和質(zhì)粒載體pcDNA3.1()經(jīng)限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后，在T4噬菌體DNA連接酶作用下進(jìn)行鏈接反應(yīng)，取5μL鏈接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，取200μL

8、轉(zhuǎn)化液鋪于LB平板固體培養(yǎng)基（含氨芐青霉素50μgμL），37℃孵育過夜，次日隨機(jī)挑取陽性克隆接種2mL含50μgμL的LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)1618h后提取質(zhì)粒DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測進(jìn)行初步篩選，對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切和DNA測序鑒定。1.5細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染食管癌Eca109細(xì)胞以相同細(xì)胞數(shù)接種25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置CO2孵箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)用于轉(zhuǎn)染，細(xì)胞分為三組，每組3瓶細(xì)胞，第一組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒p