辣椒素合成結(jié)構(gòu)基因及MYB轉(zhuǎn)錄因子的克隆和功能驗(yàn)證.pdf

1、辣椒素（Capsaicin）作為一類只在辣椒屬植物中合成的次生代謝產(chǎn)物，是辣椒（Capsicum spp.）果實(shí)品質(zhì)的重要部分。雖然“涮涮辣”是辣椒素含量極高的中國辣椒（Capsicum chinense Jacquin）品種，但是其坐果率低，生長周期長，抗病性差，產(chǎn)量低，不便用于辣椒素生產(chǎn)的原料品種，因此挖掘參與調(diào)控辣椒素合成的關(guān)鍵基因或轉(zhuǎn)錄因子，弄清他們的作用機(jī)制，既有利于理解辣椒素積累的分子機(jī)理，又有利于提供調(diào)控辣椒素含量的供體基

2、因，以便于將高辣椒素基因轉(zhuǎn)到經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良的品種中。盡管目前對辣椒生物合成途徑中的關(guān)鍵基因的研究已取得了重要進(jìn)展，但不同辣度材料結(jié)構(gòu)基因、啟動(dòng)子之間是否存在差異，受到哪些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控還尚未弄清。AT3只在有辣味的辣椒中表達(dá)，辣椒素只在胎座中合成，合成途徑相同辣度卻存在著差異，表達(dá)的時(shí)空特異性暗示了 AT3的重要性以及其合成途徑受到轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的可能性。本研究通過對三種不同辣度的辣椒素合成重要結(jié)構(gòu)基因的克隆及表達(dá)量進(jìn)行分析，找出了重要的結(jié)

3、構(gòu)基因AMT、AT3；對“涮涮辣”AT3啟動(dòng)子進(jìn)行活性分析，發(fā)現(xiàn)一些增強(qiáng)區(qū)域存在轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控元件；并且對可能調(diào)控它的MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行初步驗(yàn)證。取得的研究結(jié)果如下：
　　1、由于辣椒素只在胎座中合成，所以對高辣辣椒“740”（“涮涮辣”）、中辣辣椒“59”以及無辣甜椒“170”胎座的RNA進(jìn)行提取，反轉(zhuǎn)錄成cDNA,克隆9個(gè)重要的辣椒素合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因，利用生物信息學(xué)手段對其進(jìn)行序列比對分析，并對果肉和胎座中的表達(dá)量進(jìn)行分析，

4、發(fā)現(xiàn)AMT和AT3在果肉和胎座的表達(dá)量有明顯差異，AT3在甜椒中出現(xiàn)大片段的缺失，沒有起始密碼子，不能合成AT3酶，由此可知AMT和AT3在辣椒素合成過程中具有重要作用。
　　2、選擇AT3和AMT兩個(gè)基因，構(gòu)建VIGS表達(dá)載體，對其進(jìn)行沉默，在花后16天采集辣椒胎座，進(jìn)行表達(dá)量分析，胎座中的AT3和AMT表達(dá)量顯著下降，花后45天采集胎座進(jìn)行辣椒素含量測定，發(fā)現(xiàn)AMT的辣椒素含量下降了25％，AT3沉默植株的辣椒素含量幾乎沒有變

5、化。
　　3、前期研究表明，有大量 MYB轉(zhuǎn)錄因子在胎座中顯著上調(diào)表達(dá)，暗示著 AT3可能受MYB轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對“740”的AT35’端上游1889bp啟動(dòng)子進(jìn)行分析，找出其可能的MYB結(jié)合位點(diǎn)，以不破壞MYB結(jié)合位點(diǎn)為原則，構(gòu)建了5個(gè)5’端缺失表達(dá)載體，采用 PEG融合進(jìn)入辣椒胎座原生質(zhì)體中，通過熒光顯微鏡進(jìn)行熒光觀察，找出了747bp的活性區(qū)域，再以此活性區(qū)域?yàn)槟０?，?gòu)建5個(gè)中間缺失表達(dá)載體，導(dǎo)入辣椒胎座原生質(zhì)體中，通過熒光顯微

6、鏡進(jìn)行檢測，最終確定了237bp的活性區(qū)域，該區(qū)域含有兩個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，故而推測其受MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。
　　4、以“740”cDNA為模板，參照辣椒基因組序列，克隆出了CcMYB86、CcMYB2、CcMYB48、CcMYB59，并進(jìn)行表達(dá)量的分析，發(fā)現(xiàn)除CcMYB86外，CcMYB2、CcMYB48、CcMYB59在胎座中的表達(dá)量都明顯高于果肉。
　　5、轉(zhuǎn)錄因子行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控需要在細(xì)胞核中才能進(jìn)行，對 CcM

7、YB86、CcMYB2、CcMYB48、CcMYB59序列分析表明其都具有保守的R2R3結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族，且亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示其都屬于核定位。
　　6、將CcMYB86、CcMYB2、CcMYB48、CcMYB59構(gòu)建到pTRV2載體中，用VIGS手段將其沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在沉默植株中，CcMYB86、CcMYB2、CcMYB59在胎座中的表達(dá)量顯著下調(diào)，辣椒素合成相關(guān)基因BCAT、COMT、AMT、AT3的