構(gòu)建原代分離培養(yǎng)與鑒定小鼠肺泡ⅱ型上皮細(xì)胞的方法及模型

1、中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)第74謄第15嬲2010—04—09出版JournalofClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearchApril9，2010VoL14，No15構(gòu)建原代分離培養(yǎng)與鑒定小鼠肺泡II型上皮細(xì)胞的方法及模型：l：：|：☆鄭金旭，黃振杰，湯艷，丁明《輜％槲№《目螭∞赫Ⅻ目目∞#∞黼《$目黼黼熵m$#Ⅻ∞∞Ⅻ∞《《Ⅻ∞《踹∞螄Ⅻ％㈣㈣@∞Ⅻ№Ⅻ#∞∞械№#镕剿№@黼Ⅻ《黼

2、ⅫⅫ№∞∞蛹∞∞#@ⅫⅫmW㈥∞W酣∞≈$∞Ⅻ∞酬％Ⅻ№@@Ⅻ∞滯∞《№‰∞@姆Ⅻ㈣№№Ⅻ∞Ⅻ$Ⅻ∞㈣Ⅻ㈣ⅫⅫ∞∞∞∞《ⅫWWN嘲镕㈣㈣Ⅻ斕鯽《Ⅻ@∞《瓣Ⅻ㈣∞∞《磷№‰獼Isolation，primarycultureandidentificationoftype11alveolarepithelialcellsfrommiceZhengJinxu，HuangZhen_jie，TangYan，DingMingAbstractBACKG

3、ROUND：TypeIIalveolarepithelialcells(AECII)playanimportantroleinlungdevelopmentandregulationof1ungfunction1tiscloselyrelatedwiththegenesisanddevelopmentofpulmonaryfibrosis1ungcancerandsoon1nordertomakean『仃vitrostudyofthes

4、ediseasesastableandeffectivecelImodeIforisolationprimarycultureandidentificationofAECIIshouldbeestablishedOBJECTlVE：TOdevelopareliablemethodfortheisolation，purification，primarycultureandidentificationofAECIIfrOmmice，andp

5、rovideafoundationforthefurtherstudyofpulmonaryfibrosisandlungcancerMETHODS：①ThelungtissueofmicewasdigestedwithlowconcentrationtrypsinandcollagenaseIThatis，lungtissuesofmicewerecutintosmallpieces，digestedwithtrypsin，andte

6、rminatedthedigestionbyaddingDMEMcontainingfetalbovineserumThecellsweredigestedonceagainusingtrypsinandaddingcollagenaseIaftertermination(函AEC11waspurifiedbydifferentialcentrifugationandimmuneadherenceforprimarycultureThe

7、pneumocytessuspensionwasincubatedinIgGcultureplate，andliquidcontainingnonadherentcellswereonceagainculturedinIgGcultureplate，thensupernatantwereabandoned，andthecellswereculturedjnculturedishandcultureplateThemorphologyan

8、dgrowthcharacteristicsofprimarilyculturedAEC11wereobservedbyanjnvertedmicroscope；theyieldpurityandviabilityofAEC11weredeterminedAEC11wasidentifiedbyimmunocytochemicalstainingsudactantapoproteinA(SPA)andSPC，andthespecific

9、celIstructurewasobservedunderatransmissionelectronmicroscopeRESULTSANDCONCLUSlON：Bythismethod。anamountof(4812)x105AEC11wereharvestedfromeachmousewithapurityof(85土24)％andaviabilityof(9224)％Underaninvertedmicroscope，AECIIi

10、nprimarycultureshowedashapeofroundorcubeandanisland—likegrowthThejmmunocytochemistryshowedthatthecytoplasmpresentedbuffySP—AandgreenSP—CTypicaIfeaturesofAECIIincludingIamellarbodiesandmicrovillicouldbeseenunderatransmiss

11、ionelectronmicroscopeTheresultsdemonstratedthat，AECIrofgreatamountandhighpuritycouldbeobtainedbythismethod，whichmeetstherequirementofacellmodelestablishingforfurther／nvitrostudyZhengJX，HuangZJ，TangY，DingMIsolation，primar

12、ycultureandidentificationoftypeIIalveolarepithelialcellsfrommiceZhongguoZuzhiGongchengYanjiuyuLinchuangKangfu2010；14(151：2761—2764【http：／／wwwcrtercnhttp：／／enzglckfcorn】摘要背景：肺泡II型上皮細(xì)胞在肺發(fā)育和肺功能調(diào)節(jié)中起重要作用，它與肺纖維化和肺癌等疾病的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)

13、系，為了對(duì)這些疾病進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究，必須對(duì)肺泡II型上皮細(xì)胞進(jìn)行分離、原代培養(yǎng)與鑒定以建立一個(gè)穩(wěn)定高效的細(xì)胞模型。目的：建立一套可靠的小鼠肺泡II型上皮細(xì)胞分離、純化、原代培養(yǎng)與鑒定的方法，為肺纖維化及肺癌等疾病的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。方法：①用低濃度胰酶聯(lián)合I型膠原酶消化法，分離小鼠肺組織細(xì)胞成分。取出小鼠肺組織，剪成小塊，加入胰蛋白酶，移出細(xì)胞懸液，加入含胎牛血清的DMEM中止消化；同法用胰蛋白酶再消化1次中止消化后加入I型膠原酶，再

14、中止消化。②經(jīng)差速離心差速貼壁和免疫黏附法純化肺泡II型上皮細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)。將肺細(xì)胞懸液接種入包被小鼠IgG的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，吸出含未黏附細(xì)胞的液體接種于另一包被小鼠IgG的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，吸出未黏附細(xì)胞，去上清，重懸沉淀，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板中培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特點(diǎn)，測(cè)定肺泡II型上皮細(xì)胞產(chǎn)量、純度及活力，免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定肺泡表面活性蛋白A和肺泡表面活性蛋白C的表達(dá)，透射電鏡鑒定肺泡II型上皮細(xì)胞特異性細(xì)胞結(jié)

15、構(gòu)。結(jié)果與結(jié)論：用此方法，每只小鼠獲得肺泡II型上皮細(xì)胞(4812)105，純度達(dá)至U(85024)％，細(xì)胞活力為(92024)％，倒置顯微鏡下原代肺泡II型上皮細(xì)胞呈圓形或立方形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量反差明顯的細(xì)小顆粒，細(xì)胞為島狀生長(zhǎng)方式；免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，肺泡表面活性蛋白A呈棕黃色，肺泡表面活性蛋白C呈綠色，均定位表達(dá)于細(xì)胞漿；透射電鏡見(jiàn)特征性板層小體和細(xì)胞游離面大量微絨毛。證實(shí)利用胰酶聯(lián)合膠原酶消化，差速離心差速貼壁和免疫黏附純化的方法

16、可獲得高產(chǎn)量高純度的AECII，能滿足一般的體外實(shí)驗(yàn)要求。關(guān)鍵詞：小鼠；肺泡II型上皮細(xì)胞；原代培養(yǎng)；分離；鑒定：心肺組織工程doi：103969／jissn16738225201015024鄭金旭，黃振杰，湯艷，丁明構(gòu)建原代分離培養(yǎng)與鑒定小鼠肺泡iI型上皮細(xì)胞的方法及模型[J】中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(15)：27612764[http：／／wwwcrterorghttp：／／cnzglckfcorn]0引言肺泡是肺

17、臟進(jìn)行氣體交換的基本單位，其表面被覆的單層肺泡上皮主要由肺泡I型和II|SsN16738225CN21—1539，RcoDEN：zLKHAH型上皮細(xì)胞構(gòu)成。肺泡II型上皮細(xì)胞(typeIIalveolarepithelialcell，AECII)僅襯附肺泡壁表面積的5％～10％但卻構(gòu)成肺泡細(xì)胞群的60％，它又被稱(chēng)為“顆粒性肺泡細(xì)胞”和“分泌細(xì)胞”，是一種多功能細(xì)胞，對(duì)維持肺泡結(jié)DepartmentofRespiratoryMedicin

18、eAffiliatedHospitalofJangsuUniversity，Zhenjiang212001JiangsuProvince，ChinaZhengJinxu☆DoctorProfessorDoctoraIsupervisorChiefphysicianDepartmentofRespiratoryMedicine，AffiliatedHospitalofJangsuUniversityZhenjiang212001，Jian

19、gsuProvince，Chinajxuzhl35@163comSupportedby：theScienceResearchFoundationofMinistryofHealth，Nowkj20060026。333”P(pán)rojectofJiangsuProvince，No2007—1609Received：20091016Accepted：20091219江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，江蘇省鎮(zhèn)江市212001鄭金旭☆，男，1961年生，江蘇省

20、宜興市人，1994年上海醫(yī)科大學(xué)(現(xiàn)復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院)畢業(yè)，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事肺間質(zhì)病與肺癌的研究。jxuzhl35@163com中圖分類(lèi)號(hào)：R318文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1673—8225(2010)150276104收稿日期：20091016修回日期：20091219(20090916017州’Z)2761萬(wàn)方數(shù)據(jù)鄭參瞧等構(gòu)建啄代分離培養(yǎng)與攀定小鼠蝻泡1I蛩|。受組跑的奇法硬挺壁7易2wⅢcR職。rg微鏡

21、下計(jì)算活細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，拒染的即為活細(xì)胞，算出活細(xì)胞的百分比。主要觀察指標(biāo)：①?gòu)男∈蠓谓M織中分離肺泡II型上皮細(xì)胞，進(jìn)行純化和培養(yǎng)并觀察其生長(zhǎng)情況。②通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察肺泡II型上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物SPA、SP—C的表達(dá)。③肺泡II型上皮細(xì)胞在透射電鏡下的形態(tài)特征。設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為第一、二作者，干預(yù)實(shí)施為第二、三作者，評(píng)估為第四作者，均經(jīng)過(guò)正規(guī)培訓(xùn)，采用盲法評(píng)估。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：由第一作者采用SPSS16O軟件

22、完成統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果21小鼠AECII的產(chǎn)量及純度、活力每只小鼠肺組織經(jīng)酶消化分離、純化、培養(yǎng)72h后平均收獲AEC11(4312)106(n=6)，純度達(dá)到(85024)％(門(mén)=6)，細(xì)胞活力為(92024)％(門(mén)=6)。22倒置顯微鏡下原代培養(yǎng)的小鼠AECII細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及變化見(jiàn)圖1。|SSN1673—8225CN21—1539，RcoDEN：zLKHAH免疫黏附純化后的小鼠AECII在接種后1218h開(kāi)始伸展貼壁，形態(tài)呈圓形或

23、立方形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量反差明顯的細(xì)小顆粒，胞核明顯，細(xì)胞為島狀生長(zhǎng)方式。培養(yǎng)24hA，逐漸融合，3648h細(xì)胞平展呈多邊形，相互連接成細(xì)胞單層。培養(yǎng)72h后，細(xì)胞內(nèi)顆粒逐漸減少，六七天明顯減少，無(wú)法辨認(rèn)II型細(xì)胞形態(tài)。對(duì)照組(免疫黏附的細(xì)胞)培養(yǎng)48h后大量成纖維細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)呈梭形或不規(guī)則三角形，相互連接成網(wǎng)狀，還可見(jiàn)到I型肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。生長(zhǎng)方式及形態(tài)完全不同。23免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定小鼠AECⅡ的SPA、SPC表達(dá)見(jiàn)圖2。免疫