臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范

1、臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范 床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范為使基因擴增檢驗技術(shù)有效地應(yīng)用于臨床，更好地為疾病的預(yù)防、診斷和治療服務(wù)，保證檢驗質(zhì)量，特制定本規(guī)范。 一、臨床基因擴增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置及其管理 一、臨床基因擴增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置及其管理 臨床基因擴增檢驗實驗室的規(guī)范化設(shè)置詳見《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》(衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10 號文)附件《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設(shè)置標準》。為避免污染，必須嚴格遵循《臨

2、床基因擴增檢驗實驗室設(shè)置標準》設(shè)置臨床基因擴增檢驗實驗室。臨床基因擴增檢驗實驗室四個隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。各區(qū)域都必須有明確的標記，以避免設(shè)備物品如加樣器或試劑等從其各自的區(qū)域內(nèi)移出從而造成 不同的工作區(qū)域間設(shè)備物品發(fā)生混淆。進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)(簡稱擴增區(qū))至產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯

3、區(qū)別標志的工作服，以便于鑒別。此外，當工作者離開工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。清潔方法不當也是污染發(fā)生的一個主要原因，因此實驗室的清潔應(yīng)按試劑貯存和準備區(qū)至擴增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進行。不同的實驗區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。(一)試劑貯存和準備區(qū) 試劑貯存和準備區(qū) 下述操作在該區(qū)進行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。貯存試劑和用于標本制備的材料應(yīng)直接運送至試劑貯存和準備區(qū)，不能經(jīng)過產(chǎn)物分析區(qū)。在打開含有反

4、應(yīng)混合液的離心管或試管前，應(yīng)將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。當貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應(yīng)將其分裝 貯存?zhèn)溆茫苊庥捎诮?jīng)常打開反應(yīng)管吸液而造成污染。含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴增的試劑都應(yīng)冰 凍貯存。為避免因單次反應(yīng)取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實驗室內(nèi)一次測定所需的擴增反應(yīng)數(shù)來決定。主反應(yīng)混合液的組成成份

5、尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過預(yù)試驗來檢查，評價結(jié)果必須有書面報告。對于“熱啟動“技術(shù)(在第一個高溫變性步驟后加入酶)，聚合酶也可不包含在 主反應(yīng)混合液中。在整個本區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次 性帽子也是一個有效地防止污染的措施。嚴禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進行清潔。本工作區(qū)的實驗臺表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外

6、照射應(yīng)方便有效。由于紫外照射的距離和能的方法是在打開反應(yīng)管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機，因其所占實驗臺面 小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過的加樣器必 須注意清潔消毒。完成操作及每天工作后都必須對實驗室臺面進行清潔和消毒，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。(四)擴增產(chǎn)物分析區(qū) 擴增產(chǎn)物分析

7、區(qū) 下述操作在本區(qū)內(nèi)進行：擴增片段的測定。核酸擴增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標記或非同位素標記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern 轉(zhuǎn)移、核酸測序方法等。目 前國內(nèi)的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標記的微孔板上探針雜交方法，即 PCR-ELISA 方法，也有膜上探針雜交方法。本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。在使用 PCR-EL

8、ISA 方法檢測擴增產(chǎn)物時，必須使用洗板機洗板，廢液必須收集至 1mol/L HC1 中，并且不能在實驗室內(nèi)傾倒，而應(yīng)至遠離 PCR 實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至 1mol/L HCl 中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應(yīng)注意實驗人員的安全防護。本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。本區(qū)如采用負壓條件或減壓情況下(如安裝排風(fēng)扇)可減

9、少擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至前面區(qū)域的可能性。二、臨床基因擴增檢驗實驗室質(zhì)量保證 二、臨床基因擴增檢驗實驗室質(zhì)量保證 臨床基因擴增檢驗實驗室質(zhì)量保證涉及到整個基因擴增檢驗的所有階段，即測定分析前的標本采集處理、測定中的核酸提取、擴增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報告等。(一)標本的采集 標本的采集 常用于基因擴增檢測的臨床標本包括 EDTA 或枸櫞酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、腦脊液、尿及分泌物等。采血液等樣本時，應(yīng)使用一次性密閉容器，如真