蝦肝腸胞蟲（ehp）檢測 套式pcr法（意見征求稿）編制說明

1、浙江省地方標準《蝦肝腸胞蟲(EHP)檢測套式PCR 法》編制說明一、項目背景蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoonhepatopenaei，EHP）又稱“腸胞蟲”，屬于微孢子蟲科，腸胞蟲屬，是一種可感染多種真核生物的專性細胞內(nèi)寄生蟲， 2004年最早發(fā)現(xiàn)于泰國養(yǎng)殖的斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)，2009 年被正式命名報道。近年來先后在澳大利亞、中國、印度、越南、印度尼西亞、馬來西亞等亞太地區(qū)主要對蝦養(yǎng)殖國家發(fā)現(xiàn)，嚴重影響對

2、蝦正常生長，已成為阻礙對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病原。近幾年的中國水生動物衛(wèi)生狀況報告顯示，我國沿海多省份養(yǎng)殖蝦類蝦肝腸胞蟲病病原陽性檢出率均高達 30% 以上。。浙江省南美白對蝦產(chǎn)量 113514 噸，已成為我省水產(chǎn)養(yǎng)殖的主導產(chǎn)業(yè)之一。省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站蝦已連續(xù)多年對南美白對蝦苗種疫病進行監(jiān)測，結(jié)果表明：2015-2018 年 EHP 陽性檢出率逐年上升，最高可達 47.1%。EHP 感染雖不會造成蝦類的大量死亡，但可引起生長緩慢或停滯，

3、嚴重的甚至養(yǎng)殖 90 天以上的規(guī)格小于 4 克/尾，不得不采取排塘措施，經(jīng)濟損失慘重，嚴重影響了對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。2018 年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已將 EHP 作為新發(fā)疫病納入國家水生動物疫病監(jiān)測，并在其組織的水生動物防疫系統(tǒng)實驗室檢測能力測試中增加該項測試。EHP 可通過水平和垂直傳播，包括經(jīng)口攝食傳播，或直接通過養(yǎng)殖水體在對蝦中進行傳播，主要感染蝦的腸道表皮，進而感染肝胰腺，引起對蝦腸道吸收功能下降，嚴重的出現(xiàn)腸炎和肝胰腺萎縮，導致蝦生長出

4、現(xiàn)遲緩。但 EHP 感染無明顯的早期臨床癥狀，也并不導致對蝦死亡，感染 EHP 的蝦食欲表現(xiàn)正常，并不停止攝食，空耗飼料、水電和人工等，因而，EHP 早期感染不易被發(fā)現(xiàn)。此外由于 EHP 細胞內(nèi)寄生的特性，目前也未有能夠殺滅或者控制其發(fā)展的有效藥物，因此早期快速檢測技術(shù)的建立至關(guān)重要，從源頭防控該病原的感染。標準制修訂項目公開招標，將《蝦肝腸胞蟲(EHP)檢測套式 PCR 法》標準列入規(guī)劃。（二）標準制定協(xié)作單位本標準制訂工作由浙江省水

5、產(chǎn)技術(shù)推廣總站主持，浙江省休閑觀賞漁業(yè)行業(yè)協(xié)會、浙江省海水水產(chǎn)研究所、杭州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心等單位共同協(xié)作實施，成立了標準制訂小組，分工協(xié)作，開展標準的起草、審查、征求意見及審定等工作。（三）主要起草人及其分工標準制定任務(wù)下達后，2019 年 8 月，組成了標準起草工作組，明確了任務(wù)要求，安排了工作進度。起草小組標準起草人員構(gòu)成，見表 1。表 3 標準起草小組構(gòu)成表姓名 專業(yè) 職稱 主要任務(wù)朱凝瑜 預防獸醫(yī) 工程師 項目主持人鄭曉葉 漁

6、業(yè) 工程師 技術(shù)指標確認梁倩蓉 水生動物醫(yī)學 助理工程師 試驗數(shù)據(jù)整理、分析周凡 水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料 高工 參與編制制定葉鍵 水產(chǎn)養(yǎng)殖 高工 方法驗證許婷 水產(chǎn)養(yǎng)殖 講師 方法驗證黃家慶 淡水漁業(yè) 高工 參與編制制定丁雪燕 水產(chǎn)養(yǎng)殖 研究員 項目指導吳洪喜 水產(chǎn)養(yǎng)殖 研究員 項目指導（四）編制工作情況標準起草單位在接到該標準制訂任務(wù)后，按要求成立了標準制訂小組，查閱相關(guān)的專著、期刊，對國際和國內(nèi)關(guān)于腸胞蟲的檢測方法的相關(guān)標準和相關(guān)論文等

7、資料進行了調(diào)研，熟悉了目前已有的檢測方法及其優(yōu)缺點。2019 年~2020 年，選取近年來采集的具有典型代表的 21 個南美白對蝦樣本、6 個餌料樣本及 15 個水樣，在套式 PCR 基礎(chǔ)上增加了水樣處理方法，擴大了檢測方法的使用范圍。同時根據(jù) swp 序列設(shè)計引物，建立 SYBR q-PCR 及 LAMP 檢測方法，提高了檢測靈敏度，縮短了檢測時間。2021 年 1-6 月又對兩種方法中的條件進行了優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上，起草了省級地方標準