磁性微球表面瞬時衍生化學(xué)發(fā)光新技術(shù)檢測特定序列DNA的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究表明:許多疾病如癌癥和遺傳病的發(fā)生都與基因的突變有關(guān),另外許多傳染性疾病足出環(huán)境中的病毒、病菌或寄生蟲所引起,因此對特定序列DNA的分析以及對DNA鏈中堿基突變的撿測存基因篩選、法醫(yī)學(xué)簽定、遺傳疾病的早期診斷和治療、病原基因的測定方面具有十分深遠的意義。近年來,快速可靠的特定序列DNA檢測技術(shù)得以迅速發(fā)展。大量的研究以晦、同位素、熒光、電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光等標(biāo)記物標(biāo)記 DNA探針,建立高靈敏度、高選擇性的特定序列 DNA 的檢

2、測技術(shù)。鑒于 DNA 探針標(biāo)記物的存在,一定程度上復(fù)雜化了傳感器的制備和使用,所以無標(biāo)記型DNA檢測技術(shù)的研究成為病原基因測定和基因疾病診斷領(lǐng)域新的研究熱點之一。 化學(xué)發(fā)光(CL)分析法不需要光源,避免了雜散光的干擾,因此具有極高的靈敏度;且這一方法儀器設(shè)備簡單、操作簡便,因而得到了迅速發(fā)展。目前,CL 分析成為一個非常活躍的研究領(lǐng)域,已成助地用于藥學(xué)、生物學(xué)、分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和環(huán)境學(xué)中各種物質(zhì)的檢測。2003年,本研究小組

3、首次報道了基于鳥嘌呤特異性化學(xué)發(fā)光的無標(biāo)記 (瞬時衍生)DNA檢測新技術(shù)。 本論文旨在發(fā)展了一系列具有創(chuàng)新意義的磁性微球表面瞬時衍生化學(xué)發(fā)光DNA檢測技術(shù),由以下部分構(gòu)成: 第一章:緒論 第一節(jié),介紹了特定序列DNA檢測的研究進展及其意義,內(nèi)容包括:熒光、電化學(xué)、表面基質(zhì)共振和石英微晶天平法等,并列舉了近年來它們在該分析領(lǐng)域的典型示例;第二節(jié),介紹了主要的CL體系(如魯米諾體系、過氧化草酸酯體系、吖啶酯體系和堿性

4、磷酸酯酶體系)的原理、特點以及應(yīng)用,尤其是在免疫和DNA分析領(lǐng)域的應(yīng)用。第三節(jié),闡述了本論文的目的和意義,指出了論文的主要研究內(nèi)容及創(chuàng)新之處。 第二章:基于Poly T修飾的磁性微球表面瞬時衍生特定序列DNA化學(xué)發(fā)光檢測新技術(shù)1.端粒特定序列檢測新技術(shù)端粒是染色體3’末端的重復(fù)性序列,由一種核糖核蛋白復(fù)合體——端粒酶在一定條件下合成。端粒和端粒酶具有保護細(xì)胞不被融合、降解的重要作用,它們最的多少與惡性腫瘤等疾病的發(fā)生密切相關(guān),因

5、此這一基因片段的測定對重大疾病的早期診斷和防治具有重要意義?;诖判晕⑶虮砻嫠矔r衍生化學(xué)發(fā)光,建立了一種新型的端粒特定序列DNA無標(biāo)記檢測技術(shù)。整個分析過程由以下三個實驗步驟構(gòu)成:(1)dT<,20>修飾的磁性微球。與連接有dA<,20>,的捕獲探針雜交;(2)再與端粒特定序列DNA進行第二次雜交;(3)磁性分離洗滌,基于 3,4,5-三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)與端粒中富含的鳥嘌呤(G)反應(yīng)產(chǎn)生的特異性 CL,進行端粒DNA的無標(biāo)記

6、檢測。結(jié)果表明:該法具有操作簡便、分析快速和靈敏度高等特點。目標(biāo)序列濃度在 5-100 nM 濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9918,最低檢測濃度為0.5 nM。 2.炭疽桿菌特定序列檢測新技術(shù)作為一種全球性的生化武器,炭疽桿菌引起了公眾以及軍事部門的熱切關(guān)注,建立實時有效的識別、檢測技術(shù),對控制其傳播具有重要意義。本節(jié)以炭疽相關(guān)的一段含有 30個堿基的序列作為研究對象,構(gòu)建了無標(biāo)記CL檢測技術(shù),并進一步發(fā)展了基于G<,3

7、0>序列的放大檢測方法。放大檢測技術(shù)可描述如下:首先通過A<,20>-T<,20>雜交反應(yīng)將捕獲探針固定于磁性微球表面;捕獲探針15個核苷酸單位與目標(biāo)序列相應(yīng)序列段雜交結(jié)合;然后加入報告序列與目標(biāo)序列的另外15個核苷酸單位進行第三次雜交反應(yīng);利用TMPG與目標(biāo)序列和報告序列中富含的G堿基反應(yīng)產(chǎn)生的CL來檢測。報告序列含有兩個功能序列段:一是能夠與目標(biāo)序列的15個核苷酸單位雜交的序列段,另一個是富含 G 的序列段——(T<,2>G<,15

8、>)<,2>,結(jié)果表明:在6-60 nM的濃度范圍內(nèi),CL 信號呈線性增加(R<'2>=0.9984),最低檢測濃度為6 nM;采用G<,30>報告序列放大檢測技術(shù),目標(biāo)序列在0.45-6 nM濃度范圍內(nèi),線性良好(R<'2>=0.9917),最低檢測濃度為 0.415 nM(0.045 pmol):放大檢測技術(shù)較不放大技術(shù)靈敏度提高了一個數(shù)量級,且對 A-A 單堿基錯配識別良好。 第三章:基于羧基修飾磁性微球表面瞬時衍生的無標(biāo)

9、記化學(xué)發(fā)光檢測新技術(shù)本章以炭疽桿菌特定序列DNA為研究對象,采用羧基修飾的磁性微球為分離和預(yù)富集載體,通過羧基——氨基縮合反應(yīng)固定捕獲探針,雜交目標(biāo)序列后利用 G 堿基的特異性CL 反應(yīng)來檢測,并在此基礎(chǔ)上發(fā)展了G<,30>放大檢測技術(shù)。該技術(shù)操作簡單,不放大檢測技術(shù)可表述為:在一定條件下,羧基磁性微球經(jīng)過EDC活化后,結(jié)合炭疽桿菌特定序列的捕獲探針,然后通過雜交反應(yīng)結(jié)合目標(biāo)序列,洗滌轉(zhuǎn)移后利用特異性反應(yīng)試劑 TMPG直接測定目標(biāo)序列中

10、的G堿基;G<,30>放大檢測技術(shù)是一種夾心方法,在上述第一步雜交完成后,加入一段富含G的報告序列,與目標(biāo)序列另外15個核苷酸單位進行第二次雜交反應(yīng),洗滌轉(zhuǎn)移后檢測TMPG與目標(biāo)序列和報告序列中富含的G反應(yīng)產(chǎn)生的CL信號。結(jié)果表明:該方法具有準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性和選擇性好的特點。目標(biāo)序列濃度在2-5 nM范圍內(nèi),CL 信號呈線性增加(R<'2>=0.9962),最低可檢測濃度為 2nM;G<,30>放大技術(shù),目標(biāo)序列濃度在 50 pM-4

11、nM 范圍內(nèi),CL 信號線性相關(guān)性良好(R<'2>=0.9965),最低檢測濃度為50 pM,較不放大技術(shù)靈敏度提高一個數(shù)量級。 第四章:基于碳納米管放大的特定序列DNA化學(xué)發(fā)光檢測新技術(shù)本章以羧基修飾的磁性微球作為分離以及預(yù)富集載體,以碳納米管(CNTs)這種新型納米材料作為放大載體,發(fā)展了一種高靈敏度CL新技術(shù)檢測特定序列DNA。該技術(shù)利用夾心雜交檢測法:(1) 將氨基修飾的捕獲探針固定于經(jīng)過EDC活化的羧基修飾的磁性微球表

12、面;(2) 通過第一步雜交將目標(biāo)序列結(jié)合于磁性微球表面;(3)表面羧基功能化的碳納米管,經(jīng)過EDC活化后結(jié)合大量氨基修飾的報告序列形成放大復(fù)合物,通過第二步雜交反應(yīng)將放大復(fù)合物結(jié)合于磁性微球表面;(4) 檢測 TMPG 與目標(biāo)序列和放大復(fù)合物中的 G 堿基反應(yīng)產(chǎn)生的CL信號。報告序列出兩個功能序列段組成:一是富含G的序列段,二是和目標(biāo)序列互補的序列段;各類CNTs經(jīng)過濃硫酸一過氧化氧(9∶1)的混合溶液氧化處理后形成表面羧基功能化的 C

13、NTs-COOH;通過TEM以及粒度/zeta電位測定儀對其性質(zhì)進行表征。研究了四種碳納米管的放大效果,并最終選用兩種作為載體進行特定序列DNA 放大檢測;該方法不需要在測定前將待測組分從分離載體上洗脫下來,也不需要用酶、熒光染料等對核苷酸作進一步的標(biāo)記,整個實驗可以在3-4 h 內(nèi)完成。 第五章:基于聚苯乙烯微球作為放大載體的特定序列DNA化學(xué)發(fā)光檢測新技術(shù)本章以商品化的鏈霉親和素聚苯乙烯微球為放大載體平臺,構(gòu)建了一種省時、省

14、力、高效的放大檢測技術(shù)。與碳納米管作為放大載體的技術(shù)相比,不需對放大載體進行表面功能化,節(jié)省分析時間,且利于放大技術(shù)的進一步發(fā)展。 第六章:基于DNAzyme的化學(xué)發(fā)光新技術(shù)檢測特定序列DNA利用羧基修飾的磁性微球作為高效分離載體,基于DNA催化酶(DNAzyme)催化Luminol和H<,2>O<,2>產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的原理,構(gòu)建了一種新型的磁性微球表面瞬時衍生特定序列DNA 檢測技術(shù)。包括以下分析步驟:(1)羧基磁性微球由EDC

15、活化后,固定氨基修飾的捕獲探針;(2)捕獲探針與目標(biāo)序列的15個寡聚核苛酸單位 (5’-AAT ATT GAT AAGGAT-3’)雜交;(3)目標(biāo)序列的另15個寡聚核苷酸犖.位(5’-GAG GGA TTA TTG TTA-3’)與報告序列的相應(yīng)序列段進行第二次雜交,報告序列含有一段能夠自我折疊形成四聚體的序列——d(TTT GGG TAG GGC GGG TTG GG),能夠特異性結(jié)合血紅素(Hemin),形成具有HRP相似催化性能

16、的復(fù)合物(DNAzyme);(4)用Luminol和H<,2>O<,2>在堿性條件與洗滌后的磁性微球反應(yīng),產(chǎn)生CL進行檢測??疾觳?yōu)化了各種實驗參數(shù),包括磁性微球量、雜交時間和CL檢測條件等。在優(yōu)化的實驗條件檢測炭疽桿菌特定序列DNA,結(jié)果表明:該法具有操作簡便和分析快速等特點,目標(biāo)序列濃度在0.2-20 nM濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9987,并在堿基錯配分辨中有一定效果,為DNA檢測提供了一種有價值分析手段。

17、 第七章:基于Lumino-NaIO<,4->環(huán)糊精流動注射的表面活性劑分析新技術(shù)這章內(nèi)容是較為早期的工作,旨在發(fā)展一種通用型的流動注射CL分析技術(shù),用于檢測各種類型的表面活性劑——陽離子型、陰離子型和非離子型表面活性劑。從工業(yè)制造、科學(xué)研究、家庭用品到環(huán)境污染物,表面活性劑是一類隨處可見的化合物。由于它們涉及到社會生活的方方面面,對于它們的研究顯得尤為重要。其中,發(fā)展相應(yīng)的分析檢測方法是對其研究的一個重要方向。本章發(fā)展的技術(shù)原理是:

18、在堿性溶液中,Luminol-NaIO<,4->多羥基化合物 (如:環(huán)糊精、葡萄糖和甘油等)體系的CL能夠被各種類型的表面活性劑不同程度的淬滅,在一定濃度范圍內(nèi),淬滅程度與表面活性劑的濃度線性相關(guān)。我們研究了該現(xiàn)象的反應(yīng)機制,認(rèn)為淬滅原因在于多羥基化合物改變了CL反應(yīng)的微環(huán)境。據(jù)此發(fā)展了適應(yīng)于三種類型表面活性劑檢測的 CL 技術(shù),陽離子型表面活性劑—CTMAB、陰離子型表面活性劑—SDS 和非離子型表面活性劑—Triton X-100。

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