化學(xué)發(fā)光均相多組分DNA分析新技術(shù).pdf

1、生物樣本中生物活性物質(zhì)的分析,尤其是蛋白質(zhì)、基因序列分析,是一個(gè)涉及到多個(gè)學(xué)科的系統(tǒng)科學(xué),依賴醫(yī)學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程等學(xué)科的進(jìn)步。多組分同時(shí)定量檢測是目前蛋白質(zhì)、基因序列等大分子化合物分析檢測的熱點(diǎn),尤其是在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。相對于單一組分分析,多組分同時(shí)分析測定具有樣品需求量少,分析時(shí)間短,重復(fù)步驟少,費(fèi)用相對低等優(yōu)點(diǎn),受到越來越多人的關(guān)注。隨著大量待篩選化合物不斷涌現(xiàn),生物分析技術(shù)面臨著巨大的挑戰(zhàn)。雖然傳統(tǒng)的基于高

2、密度多孔板的篩選技術(shù)目前還是生物分析的主要技術(shù),但是隨著人們對微球的效用、簡單性以及多功能性的認(rèn)識不斷深入,微載體以及標(biāo)記分辨技術(shù)已經(jīng)開始展現(xiàn)出巨大的市場潛力。目前基于編碼微球的篩選方法可以有效降低儀器成本和檢測費(fèi)用,但也面臨如何提高編碼數(shù)量、簡化解碼過程、提高檢測速度和準(zhǔn)確性、降低成本等方面問題,這些問題的解決有待于新型編碼材料的出現(xiàn)、新的編碼/解碼策略的發(fā)明以及計(jì)算機(jī)輔助藥物篩選等。
　　 本文主要包括三部分內(nèi)容:首先綜述了

3、目前多組分檢測技術(shù)的進(jìn)展;然后構(gòu)建了基于載體分辨的三種DNA同時(shí)分析新技術(shù)以及基于標(biāo)記物分辨的三種DNA同時(shí)分析新技術(shù)。在載體分辨三種DNA同時(shí)分析新技術(shù)構(gòu)建中,本文采用溫度敏感高分子材料、磁珠、聚苯乙烯微球作為三種DNA同時(shí)分析載體,辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光作為檢測手段來實(shí)現(xiàn)人乳腺癌基因BRCAl三種DNA序列片段(60個(gè)堿基)的同時(shí)檢測。由于三種載體具有不同的物理化學(xué)特性,如溫度敏感高分子可以在最低臨界溶液溫度(LCST)31℃以上沉

4、淀分離、磁珠磁場分離,聚苯乙烯微球簡單離心分離的特性,三種DNA能夠在同一試管中均相反應(yīng),定量檢測前將三者簡便分開,實(shí)現(xiàn)三組分同時(shí)檢測。整個(gè)雜交過程非特異性吸附小,無明顯的相互交叉干擾,檢測靈敏度高,且文中構(gòu)建的“一鍋煮”反應(yīng)步驟大大簡化了操作過程。隨后,在以上載體分辨單標(biāo)記三組分成功檢測的基礎(chǔ)上,我們引入了標(biāo)記物分辨三組分測定技術(shù)。本文以兩種標(biāo)記酶(堿性磷酸酯酶和辣根過氧化物酶)與一種納米金屬顆粒(金納米微粒)作為三種不同報(bào)告DNA序

5、列的標(biāo)記物:磁珠為單一分離載體,同時(shí)固定三種捕獲探針DNA序列;依次與目標(biāo)靶DNA序列,標(biāo)記報(bào)告DNA序列,標(biāo)記酶或納米金屬顆粒反應(yīng);雜交反應(yīng)結(jié)束后,采用不同檢測底物予以檢測載體復(fù)合物上不同標(biāo)記物,獲得相應(yīng)目標(biāo)靶DNA序列的濃度。雜交過程簡便易行,無相互交叉反應(yīng),所構(gòu)建的標(biāo)記物分辨三種DNA同時(shí)分析新技術(shù)具有較高的靈敏度。此外,鑒于酶和納米顆粒測定DNA線性范圍的不同,本法能夠適合于同時(shí)檢測樣本中含量相差很大的三種不同目標(biāo)靶DNA序列。