基于等溫雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的無(wú)標(biāo)記化學(xué)發(fā)光DNA檢測(cè)新技術(shù).pdf

1、據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的研究成果，許多疾病如癌癥和遺傳病的發(fā)生和發(fā)展都與基因的突變有關(guān)，另外許多傳染性疾病是由環(huán)境中的病毒所引起的，因此對(duì)特定序列DNA的分析以及對(duì)DNA鏈中堿基突變的檢測(cè)在基因篩選、法醫(yī)學(xué)鑒定、遺傳疾病的早期診斷和治療、病原基因的測(cè)定方面具有十分深遠(yuǎn)的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)，快速可靠的特定序列DNA檢測(cè)技術(shù)得以迅速發(fā)展，按照有無(wú)標(biāo)記物可分為標(biāo)記和無(wú)標(biāo)記兩類。標(biāo)記的DNA檢測(cè)技術(shù)靈敏度高，但在一定程度上檢測(cè)過(guò)程更為復(fù)雜

2、，且檢測(cè)成本較高。相對(duì)而言，無(wú)標(biāo)記的DNA檢測(cè)技術(shù)一般較為簡(jiǎn)單快速，成本相對(duì)較低，已將其廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、法醫(yī)學(xué)、臨床診斷學(xué)等領(lǐng)域。
　　化學(xué)發(fā)光(CL)分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光輻射確定物質(zhì)含量的一種痕量分析方法。CL分析具有靈敏度高、線性范圍寬（3-6個(gè)數(shù)量級(jí)）、分析速度快以及儀器設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單、便宜等優(yōu)點(diǎn)，已成為現(xiàn)代痕量分析中一個(gè)十分活躍的研究和應(yīng)用領(lǐng)域。2003年課題組首次報(bào)道了基于鳥(niǎo)嘌呤特異性CL的無(wú)標(biāo)記(磁性微球表面

3、瞬時(shí)衍生)DNA檢測(cè)新技術(shù)，發(fā)表在《Chemical Communications》(2003，2888-2889)。它是將無(wú)鳥(niǎo)嘌呤的DNA探針固定于磁性微球，雜交端粒序列后，利用特異性CL反應(yīng)試劑——3，4，5-三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)與目標(biāo)序列中鳥(niǎo)嘌呤產(chǎn)生瞬時(shí)的CL，進(jìn)行端粒檢測(cè)。2008年，課題組偶合PCR技術(shù)，發(fā)展了依據(jù)不同載體物理性質(zhì)差異識(shí)別、無(wú)標(biāo)記型多組分CL檢測(cè)新技術(shù)，成功應(yīng)用于3種乙肝病毒DNA的檢測(cè)，發(fā)表在200

4、8年的《Analytical Chemistry》(2008，1606-1613)。2011年，課題組通過(guò)將成百上千條的適配體序列自組裝于聚苯乙烯微球表面，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)IgE的高靈敏度、無(wú)標(biāo)記CL檢測(cè)。
　　核酸擴(kuò)增技術(shù)是指在分子生物學(xué)中對(duì)特定的DNA序列進(jìn)行體外擴(kuò)增的一種技術(shù)，如傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)以及近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)如滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(Rolling Cir

5、cle Amplification，RCA)和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Hybridization Chain Reaction，HCR)，已廣泛應(yīng)用在特定DNA序列、蛋白質(zhì)和小分子等物質(zhì)的高靈敏檢測(cè)中。
　　在課題組目前研究工作的基礎(chǔ)上，本論文將CL分析和等溫雜交鏈?zhǔn)綌U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展了兩種具有創(chuàng)新意義的高靈敏度無(wú)標(biāo)記DNA的CL檢測(cè)技術(shù)，全文由以下三部分構(gòu)成:
　　第一章:DNA檢測(cè)意義與研究進(jìn)展
　　第一節(jié)主要介紹課題背景

6、及研究意義:包括特定序列DNA檢測(cè)的意義、新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和無(wú)標(biāo)記DNA檢測(cè)的新進(jìn)展。第二節(jié)主要介紹了CL分析技術(shù)的基本原理及特點(diǎn)，并介紹CL分析技術(shù)在DNA分析領(lǐng)域的應(yīng)用。第三節(jié)主要闡述了本論文的研究目的、意義，并概括論文的主要研究?jī)?nèi)容及創(chuàng)新之處。
　　第二章:偶合雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的無(wú)標(biāo)記化學(xué)發(fā)光DNA檢測(cè)新技術(shù)
　　本章偶合HCR放大反應(yīng)，建立了特定序列DNA的無(wú)標(biāo)記CL檢測(cè)新技術(shù)。CL信號(hào)由特異性化學(xué)發(fā)光試劑3，4，5

7、-三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)與DNA序列中G堿基發(fā)生瞬時(shí)衍生反應(yīng)產(chǎn)生，無(wú)需標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)中首先驗(yàn)證了無(wú)標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)的可行性，隨后詳細(xì)考察了HCR放大效果，并優(yōu)化了各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)參數(shù)，如磁性微球的用量，捕獲探針的用量和HCR反應(yīng)條件等。研究發(fā)現(xiàn)，在1 fmol-5 pmol(10 pM-50 nM)的濃度范圍內(nèi)，CL強(qiáng)度與目標(biāo)DNA濃度呈線性相關(guān)(LogI=0.751LogC+2.001，R2=0.993)，最低可檢測(cè)濃度為1 pM。該技術(shù)采用

8、磁性微球作為富集載體，具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高的特點(diǎn)。
　　第三章:聚苯乙烯微球-雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)雙重放大的無(wú)標(biāo)記化學(xué)發(fā)光DNA檢測(cè)新技術(shù)
　　在第二章工作的基礎(chǔ)上，本章進(jìn)一步構(gòu)建了一種基于聚苯乙烯微球-HCR雙重放大的特定序列DNA的檢測(cè)新技術(shù)。首先將捕獲探針通過(guò)羧基-氨基反應(yīng)固定在磁性微球上表面，報(bào)告探針和HCR引發(fā)探針通過(guò)鏈霉親和素-生物素反應(yīng)自組裝在聚苯乙烯微球表面形成放大復(fù)合物;目標(biāo)DNA加入后，將聚苯乙烯微球放大

9、復(fù)合物雜交在磁性微球表面。由于每個(gè)聚苯乙烯微球表面結(jié)合有大量含有G堿基報(bào)告探針和HCR引發(fā)探針，構(gòu)成一級(jí)放大;隨后加入兩種HCR單體，進(jìn)行HCR擴(kuò)增反應(yīng)，得以在磁性微球表面第二次引入大量的G堿基，構(gòu)成第二級(jí)放大，然后磁性分離，TMPG檢測(cè)。結(jié)果表明:該方法具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定可靠、快速靈敏，檢測(cè)時(shí)間短的特點(diǎn)，在0.01 fmol-10 pmol(0.1 pM-100 nM)濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(R2=0.991)，最低可檢測(cè)濃度為