基于等溫雜交鏈式反應的無標記化學發(fā)光DNA檢測新技術(shù).pdf

1、據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學和生命科學的研究成果，許多疾病如癌癥和遺傳病的發(fā)生和發(fā)展都與基因的突變有關(guān)，另外許多傳染性疾病是由環(huán)境中的病毒所引起的，因此對特定序列DNA的分析以及對DNA鏈中堿基突變的檢測在基因篩選、法醫(yī)學鑒定、遺傳疾病的早期診斷和治療、病原基因的測定方面具有十分深遠的理論意義和應用價值。近年來，快速可靠的特定序列DNA檢測技術(shù)得以迅速發(fā)展，按照有無標記物可分為標記和無標記兩類。標記的DNA檢測技術(shù)靈敏度高，但在一定程度上檢測過程更為復雜

2、，且檢測成本較高。相對而言，無標記的DNA檢測技術(shù)一般較為簡單快速，成本相對較低，已將其廣泛應用于分子生物學、法醫(yī)學、臨床診斷學等領(lǐng)域。
　　化學發(fā)光(CL)分析是根據(jù)化學反應產(chǎn)生的光輻射確定物質(zhì)含量的一種痕量分析方法。CL分析具有靈敏度高、線性范圍寬（3-6個數(shù)量級）、分析速度快以及儀器設(shè)備相對簡單、便宜等優(yōu)點，已成為現(xiàn)代痕量分析中一個十分活躍的研究和應用領(lǐng)域。2003年課題組首次報道了基于鳥嘌呤特異性CL的無標記(磁性微球表面

3、瞬時衍生)DNA檢測新技術(shù)，發(fā)表在《Chemical Communications》(2003，2888-2889)。它是將無鳥嘌呤的DNA探針固定于磁性微球，雜交端粒序列后，利用特異性CL反應試劑——3，4，5-三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)與目標序列中鳥嘌呤產(chǎn)生瞬時的CL，進行端粒檢測。2008年，課題組偶合PCR技術(shù)，發(fā)展了依據(jù)不同載體物理性質(zhì)差異識別、無標記型多組分CL檢測新技術(shù)，成功應用于3種乙肝病毒DNA的檢測，發(fā)表在200

4、8年的《Analytical Chemistry》(2008，1606-1613)。2011年，課題組通過將成百上千條的適配體序列自組裝于聚苯乙烯微球表面，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)IgE的高靈敏度、無標記CL檢測。
　　核酸擴增技術(shù)是指在分子生物學中對特定的DNA序列進行體外擴增的一種技術(shù)，如傳統(tǒng)的聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)以及近年來發(fā)展起來的等溫擴增技術(shù)如滾環(huán)擴增反應(Rolling Cir

5、cle Amplification，RCA)和雜交鏈式反應(Hybridization Chain Reaction，HCR)，已廣泛應用在特定DNA序列、蛋白質(zhì)和小分子等物質(zhì)的高靈敏檢測中。
　　在課題組目前研究工作的基礎(chǔ)上，本論文將CL分析和等溫雜交鏈式擴增技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展了兩種具有創(chuàng)新意義的高靈敏度無標記DNA的CL檢測技術(shù)，全文由以下三部分構(gòu)成:
　　第一章:DNA檢測意義與研究進展
　　第一節(jié)主要介紹課題背景

6、及研究意義:包括特定序列DNA檢測的意義、新型核酸等溫擴增技術(shù)和無標記DNA檢測的新進展。第二節(jié)主要介紹了CL分析技術(shù)的基本原理及特點，并介紹CL分析技術(shù)在DNA分析領(lǐng)域的應用。第三節(jié)主要闡述了本論文的研究目的、意義，并概括論文的主要研究內(nèi)容及創(chuàng)新之處。
　　第二章:偶合雜交鏈式反應的無標記化學發(fā)光DNA檢測新技術(shù)
　　本章偶合HCR放大反應，建立了特定序列DNA的無標記CL檢測新技術(shù)。CL信號由特異性化學發(fā)光試劑3，4，5

7、-三甲氧基苯甲酰甲醛(TMPG)與DNA序列中G堿基發(fā)生瞬時衍生反應產(chǎn)生，無需標記。實驗中首先驗證了無標記檢測技術(shù)的可行性，隨后詳細考察了HCR放大效果，并優(yōu)化了各項實驗參數(shù)，如磁性微球的用量，捕獲探針的用量和HCR反應條件等。研究發(fā)現(xiàn)，在1 fmol-5 pmol(10 pM-50 nM)的濃度范圍內(nèi)，CL強度與目標DNA濃度呈線性相關(guān)(LogI=0.751LogC+2.001，R2=0.993)，最低可檢測濃度為1 pM。該技術(shù)采用

8、磁性微球作為富集載體，具有操作簡單、快速、靈敏度高的特點。
　　第三章:聚苯乙烯微球-雜交鏈式反應雙重放大的無標記化學發(fā)光DNA檢測新技術(shù)
　　在第二章工作的基礎(chǔ)上，本章進一步構(gòu)建了一種基于聚苯乙烯微球-HCR雙重放大的特定序列DNA的檢測新技術(shù)。首先將捕獲探針通過羧基-氨基反應固定在磁性微球上表面，報告探針和HCR引發(fā)探針通過鏈霉親和素-生物素反應自組裝在聚苯乙烯微球表面形成放大復合物;目標DNA加入后，將聚苯乙烯微球放大

9、復合物雜交在磁性微球表面。由于每個聚苯乙烯微球表面結(jié)合有大量含有G堿基報告探針和HCR引發(fā)探針，構(gòu)成一級放大;隨后加入兩種HCR單體，進行HCR擴增反應，得以在磁性微球表面第二次引入大量的G堿基，構(gòu)成第二級放大，然后磁性分離，TMPG檢測。結(jié)果表明:該方法具有操作簡單、穩(wěn)定可靠、快速靈敏，檢測時間短的特點，在0.01 fmol-10 pmol(0.1 pM-100 nM)濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(R2=0.991)，最低可檢測濃度為