人工核酸切割分子與核酸相互作用的研究.pdf

1、人工核酸切割分子，又稱人工核酸酶，是用化學(xué)方法合成的一類能模擬天然核酸酶斷裂核酸骨架的功能小分子。它可以發(fā)展成為有用的分子生物學(xué)工具和基因治療藥物。本論文設(shè)計(jì)合成了一系列人工核酸斷裂分子，通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)手段研究了它們與核酸間的結(jié)合，斷裂及凝聚作用。
　　 本文選用對(duì)核酸堿基具有特異性識(shí)別能力的聚酰胺體系作為修飾分子，選用具有典型水解及自由基氧化斷裂機(jī)理的雙苯并咪唑(IDB)，單雙大環(huán)多胺(Cyclen or bis-Cyclen)

2、和抗壞血酸(Vc)為模型化合物，通過(guò)不同結(jié)構(gòu)柔性手臂連接構(gòu)成一系列新型核酸切割分子。旨在利用聚酰胺對(duì)核酸的特異性識(shí)別能力，提高和增強(qiáng)切割分子對(duì)核酸斷裂的選擇性及位點(diǎn)專一性。利用化學(xué)合成的方法對(duì)上述新型切割分子進(jìn)行合成及結(jié)構(gòu)表征。
　　 在切割分子對(duì)核酸的相互作用研究中，首先利用瓊脂糖凝膠電泳方法對(duì)比研究了三類切割小分子(IDB，Bis-Cyclen and Vc)與通過(guò)聚酰胺修飾后的新型斷裂試劑(Polyamide-IDB，Po

3、lyamide-Bis-Cyclenand Polyamide-Vc)對(duì)核酸斷裂作用的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聚酰胺修飾后的切割分子，在相同條件下與原始切割分子相比對(duì)核酸的斷裂能力明顯增加，在較低的切割濃度下，可通過(guò)雙鏈切割有效將核酸斷裂為線形DNA。這種經(jīng)聚酰胺修飾提高核酸斷裂能力的結(jié)果不僅適用于水解型斷裂分子IDB和Cyclen，也適用于自由基氧化型斷裂分子Vc。此外，利用模型分析可知，Vc對(duì)核酸具有較明顯的隨機(jī)性雙鏈斷裂能力，通過(guò)聚酰

4、胺對(duì)Vc分子的修飾，將其對(duì)核酸的作用過(guò)程轉(zhuǎn)變?yōu)橛羞x擇性的非隨機(jī)性雙鏈斷裂。
　　 在人工核酸斷裂分子與核酸結(jié)合能力研究中，我們先后通過(guò)圓二色光譜，核酸熔點(diǎn)，熒光淬滅，紫外吸收光譜及Maldi-Tof等一系列光譜及質(zhì)譜方法量化分析了小分子斷裂試劑在通過(guò)聚酰胺體系修飾前后對(duì)核酸親和能力的變化。通過(guò)對(duì)比淬滅常數(shù)C50，核酸熔點(diǎn)差△Tm及表觀結(jié)合常數(shù)Kapp等結(jié)合常數(shù)可知，聚酰胺分子的引入，使小分子切割試劑與核酸間的相互作用增強(qiáng)，親和力

5、增加，作用模式由較弱的靜電吸引作用轉(zhuǎn)化為較強(qiáng)的溝槽式結(jié)合，并顯示出聚吡咯單元的聚酰胺分子對(duì)核酸中富AT序列具有明顯的特異性結(jié)合作用。
　　 在研究中我們意外發(fā)現(xiàn)，含酰胺結(jié)構(gòu)的多胺類分子金屬配合物在一定條件下對(duì)核酸具有凝聚作用。為此，我們以雙苯并咪唑(IDB)，三氮九員環(huán)多胺(TACN)，四氮十二員環(huán)多胺(Cyclen)為模型化合物，分別連接正丁基，正丁?；鸵宜嵋阴?gòu)成九種不同結(jié)構(gòu)不同側(cè)鏈的多胺類小分子配體，討論酰胺中羰基的存在

6、及位置對(duì)核酸凝聚的影響。首先合成并表征了上述九種配體分子及其金屬配合物。
　　 利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)比了多胺分子中不含羰基，含鄰位羰基及間位羰基與核酸的相互作用，結(jié)果顯示，只有側(cè)鏈中含鄰位羰基的多胺分子(即具有酰亞胺結(jié)構(gòu))在一定條件下對(duì)核酸具有凝聚作用，具有間位羰基的分子作用較弱，而含烷基側(cè)鏈的多胺分子對(duì)核酸無(wú)凝聚作用。其中，金屬鋅配合物在一定條件下可使pUC18質(zhì)粒DNA凝聚成為1000bp左右的條帶，而金屬銅配合物在凝聚核酸

7、同時(shí)，對(duì)核酸進(jìn)行不同程度的切割，因而凝聚成大小不同的核酸顆粒，電泳中顯示為彌散條帶。此外，通過(guò)濃度、溫度及時(shí)間梯度對(duì)比實(shí)驗(yàn)證實(shí)，含鄰位羰基的多胺類金屬配合物對(duì)核酸的凝聚作用只發(fā)生在50℃和較高配合物濃度下，即配合物濃度與反應(yīng)溫度是發(fā)生凝聚作用的必要條件。選用不同種類的核酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這種在一定條件下發(fā)生的凝聚作用對(duì)不同種類的核酸具有一定普遍性。
　　 原子力顯微鏡結(jié)果顯示，這種凝聚作用是以帶正電的小分子配合物為中心，通過(guò)靜電或