小分子與DNA凸起結構的作用和高效DNA酶的篩選.pdf

1、DNA是一類重要的生物大分子，其基本功能是作為遺傳信息的載體，并起復制、轉錄遺傳信息的功能。發(fā)現(xiàn)對核酸、蛋白質等生物功能體系的生理過程具有調控作用的小分子，并以此為探針，研究小分子與生物靶分子的相互識別、相互作用和信息傳遞以及藥物與疾病的關系等具有廣泛的應用前景。
　　 凸起結構是DNA識別的一個重要主題。它的額外的沒有配對的核苷能夠與核酸結合蛋白形成復合物，也能作為小分子化合物的結合位點。核酸凸起結構在核酸的蛋白質識別、移碼突

2、變、修復酶的非正常同源重組、反義RNA的生成、DNA三聯(lián)子重復序列的延伸合成等生物過程中具有重要的生物學意義。
　　 我們利用熒光光譜研究了R/S聯(lián)萘酚氨基糖與不同核酸序列的結合能力，表明了與DNA凸起結構的結合能力；利用紫外光譜、圓二色光譜和SPR等檢測方式研究了吩噻嗪氨基糖與不同核酸序列的結合能力，研究結果表明與含有三個堿基凸起結構的DNA序列的結合能力最強。利用SPR的方法，我們同樣得到了R/S聯(lián)萘酚氨基糖和吩噻嗪氨基糖與

3、含有ATT三堿基凸起結構的DNA序列的解離常數(shù)。
　　 DNA凸起結構的結合分子對三聯(lián)子重復序列的體外復制具有刺激作用。我們利用三聯(lián)子重復序列的體外復制體系，發(fā)現(xiàn)R/S聯(lián)萘酚氨基糖、吩噻嗪氨基糖、順式/反式偶氮苯氨基糖等對重復序列的復制具有不同程度的刺激作用。反式偶氮苯氨基糖對反應具有促進作用，而紫外光照后的順式偶氮苯氨基糖對反應具有抑制作用。利用吩噻嗪氨基糖，對其他幾種單堿基重復序列，二聯(lián)和三聯(lián)重復序列在DNA聚合酶I Kle

4、now片段催化下的滑移合成進行了探討。在吩噻嗪氨基糖化合物存在下，所有序列的滑移復制均被促進。具有較不穩(wěn)定二級結構的序列均比具有形成穩(wěn)定二級結構的重復序列束滑出的產物更長。在不同的DNA聚合酶的催化下都能夠進行滑移合成。
　　 利用DDI化合物檢測了不同長度的模板序列，非重復序列和反應溫度等對三聯(lián)子重復序列體外復制擴增的影響。發(fā)現(xiàn)一定的反應時間內，短的重復序列作為模板時更容易通過擴增得到較長的產物。非重復序列能改變了重復序列的連

5、續(xù)性，能夠影響體外復制。升高反應溫度有利于滑移的進行。
　　 將吩噻嗪氨基糖、R/S聯(lián)萘酚氨基糖、不同構型的DDI和一個新制癌菌素氨基糖在同樣的反應條件下用于ATT/AAT重復序列的體外復制，發(fā)現(xiàn)小分子化合物對滑移的促進能力不同。其中吩噻嗪氨基糖的效果最弱，R型聯(lián)萘酚和新制癌菌素氨基糖的效果相對最強。比較不同的小分子化合物與凸起結構和滑移促進能力，將有助于研究重復序列的滑移機制和靶向凸起結構的小分子的設計。
　　 DNA

6、酶是具有催化活性的單鏈DNA，通常是通過體外分子進化技術得到的。這種篩選同自然界的篩選是相似的，只是加速了篩選的時間過程。為了能夠被復制，這些分子必須能夠表現(xiàn)出想要得到的催化功能，這樣就能把這種分子與其他的分子分開。篩選得到的分子通過聚合酶鏈式反應進行放大。
　　 目前已知的DNA酶能夠催化許多的化學反應，包括RNA切割，DNA連接和卟啉氧化等。但是它們的催化能力，通常比蛋白酶的催化能力低幾倍?？紤]到一個典型的體外篩選實驗，一輪

7、的篩選過程只需要隨機序列來進行單一底物的操作，如果一個DNA隨機序列庫在一個短的時間內要催化超過一個反應，只有那些具有高的催化活性，能夠多輪催化的核酸酶才能被篩選出來。我們挑選能夠進行RNA切割的DNA酶作為模型實驗，使用一個含有三臂的RNA作為底物，通過篩選得到的DNA酶在短時間內催化三個RNA切割反應。這樣得到的DNA酶將具有更高的酶活性。
　　 我們從一個200 pmol的N60的隨機序列起始，隨機序列的兩端各有一段固定序

8、列。利用一個寡核苷酸鏈作為模板將DNA隨機序列與三臂RNA底物進行連接，具有酶活性的DNA切割后產生短的產物。將分離得到的短的產物利用聚合酶鏈式反應放大后再次進行篩選，進過12的篩選后得到具有RNA切割活性的DNA酶。
　　 DNA酶的活性中心的產生同樣含有凸起結構和發(fā)卡結構，小分子化合物對凸起結構的結合可能影響DNA酶的結構對酶的活性產生調控作用。設計和合成靶向凸起結構的小分子化合物，能夠對某些含有凸起結構的生理過程產生調控，