人CYP2C19和CYP2D6新變異體的體外酶活研究及CYP2C19等位基因分型.pdf

1、細胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)是人體內外源化合物代謝的最重要的酶，參與催化多種生物轉化反應，其中大多數是氧化反應，負責藥物的代謝，致癌物及有毒化合物的清除等。CYP2C19,CYP2D6作為細胞色素P450家族的重要成員，其基因多態(tài)性是導致個體、種族間的藥物代謝差異和藥物不良反應的決定因素。其中CYP2C19*2和CYP2C19*3是可以解釋99％的東方人的遺傳多態(tài)性的弱代謝者的等位基因。因此研究二者基

2、因遺傳多態(tài)性在預測對某一治療藥物的副作用或療效不足以及進行個體化用藥方面有著非常重要的臨床意義。
　　 本研究中，我們首先以2008年在中國四個地區(qū)的400名漢族人群中大規(guī)模測序時新發(fā)現的CYP2C19 T302R(cDNA∶905C＞G)和CYP2D6_R441H(gDNA∶4045T＞C)這兩個突變位點作為研究對象，利用體外重組技術，克隆及表達CYP2C19和CYP2D6的兩個單核苷酸突變株，分析了突變對酶活性的影響。其次，

3、用傳統(tǒng)的PCR-RFLP方法對在中國人中突變率最高的CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因進行分析，統(tǒng)計了74例樣本的基因突變率，對于攜帶此類突變的人群在服用主要經CYP2C19代謝的藥物時減少藥物不良反應具有指導意義。
　　 為了研究這兩個SNPs對酶活性的影響，我們在已有的CYP2D6和CYP2C19野生型質粒模板上采用基于PCR的定點突變法引入兩個新的突變位點，構建了CYP2C19_T302R和CYP2D6_R44

4、1H的cDNA。并將其與酵母表達載體pYES2/CT連接，分別電轉入釀酒酵母細胞ycy107中，利用半乳糖誘導目的蛋白表達，通過差速離心法制備酵母微粒體，經Westem blot鑒定與預期大小相同，說明目的蛋白能夠表達。并用熒光底物CEC和底物S-美芬托英對CYP2C19 T302R進行酶活性分析，用熒光底物AMMC和底物丁呋洛爾對CYP2D6 R441H進行酶活性分析。
　　 結果：熒光底物檢測法和HPLC特異性底物檢測法都證