自噬性死亡在結(jié)腸癌化療中的作用及其機制探討.pdf

1、結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢。我國東南沿海地區(qū)發(fā)病率相對較高，發(fā)病機制尚未完全明確，主要與環(huán)境因素和遺傳因素有關(guān)。 程序性細胞死亡(PCD)對于癌細胞的惡性增值至關(guān)重要。因此，了解程序性死亡的機制以及設計特定的誘導癌細胞死亡的治療方案對疾病的治療具有重要意義。程序性細胞死亡有兩種，包括凋亡和自噬性死亡，二者具有不同的形態(tài)學特征. 凋亡(Ⅰ型PCD)是一種細胞自發(fā)的死亡機制，受多種細胞信號

2、通路的調(diào)控。凋亡具有依賴caspase參與，細胞皺縮，染色質(zhì)凝集，DNA降解和形成凋亡小體等特征。缺少凋亡性細胞死亡會導致自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生，而過度的凋亡常常又與神經(jīng)退行性疾病相聯(lián)系。 自噬性細胞死亡(Ⅱ型PCD)是另一種重要的生物學細胞死亡方式，這種細胞死亡的主要特征是大量的細胞內(nèi)含物降解，包括重要的細胞器如線粒體，被包裹進膜狀的自噬體，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體并進行降解。自噬在腫瘤的發(fā)展中具有重要的作用，癌細胞

3、的自噬水平低于相對應的正常細胞。 很多研究表明自噬與凋亡在一些情況下相互影響，甚至在有些情況下，二者受控于同一刺激物并產(chǎn)生不同的細胞反應。二者的相互作用取決于細胞環(huán)境和所受的刺激物，凋亡的發(fā)生有可能依賴于自噬的存在；其它一些情況下，自噬可能阻止凋亡的發(fā)生，抑制自噬可以提高細胞對凋亡信號的敏感性；也有一些情況下二者同時存在，但是相互獨立的，抑制自噬活動可使細胞對死亡信號的反應從Ⅱ型程序性細胞死亡轉(zhuǎn)向Ⅰ型。 Bax和PUM

4、A是關(guān)鍵的凋亡調(diào)控因子，缺失Bax和PUMA或者表達Bcl-2會抑制凋亡的發(fā)生，而這種凋亡性死亡的缺失會影響發(fā)育和促進腫瘤發(fā)生。因此在凋亡性死亡缺失的情況下，研究其它死亡方式的發(fā)生及其機制對癌癥的治療具有重要意義。 近年來，隨著對自噬多種功能研究的不斷深入，自噬在人類疾病中的作用，包括神經(jīng)退行性疾病、癌癥、免疫和防御也逐步得到認同。在對自噬眾多功能的研究中，其在細胞死亡和細胞生存中的作用是尤為重要和倍受爭議的一個方面。

5、傳統(tǒng)的腫瘤治療方案主要以凋亡為靶標，但是腫瘤發(fā)生過程中凋亡受抑已經(jīng)是被廣泛認知的重要事件。清除癌細胞不能僅僅通過凋亡性死亡，還可以通過其它死亡方式比如自噬性死亡來實現(xiàn)。當?shù)蛲鍪芤謺r，如果我們能夠激發(fā)自噬性死亡，這可能成為一種腫瘤治療的新方案。本課題就此展開研究： 第一部分，凋亡途徑缺失對結(jié)腸癌細胞化療敏感性的影響 本部分實驗使用5-FU(0，10，20，40μg/ml)處理結(jié)腸癌HCT116，HCT116 Bax-/-和

6、HCT116 PUMA-/-細胞24小時，WST-8法和臺盼藍染色法檢測細胞活力，發(fā)現(xiàn)5-FU可以明顯抑制細胞生長，呈現(xiàn)劑量依賴性，且野生型細胞和凋亡缺失細胞在各劑量點具有相近的死亡率。收集處理細胞進行凋亡檢測，發(fā)現(xiàn)野生型HCT116細胞的凋亡率顯著高于缺失細胞，但凋亡缺失細胞具有相對較高的PI攝入，綜合以上結(jié)果提示我們在缺失細胞中可能存在其它的死亡方式，比如自噬性死亡。 第二部分，自噬性死亡在化療藥物處理凋亡缺失結(jié)腸癌細胞中的

7、作用 (一)5-FU處理凋亡缺失結(jié)腸癌細胞誘導了自噬的發(fā)生 進而，我們對5-FU處理后的細胞進行自噬的相關(guān)檢測，電鏡檢測結(jié)果顯示，在缺失細胞中可見多個膜狀囊泡包裹細胞內(nèi)含物，說明存在自噬的發(fā)生，而在野生型細胞中無明顯自噬泡出現(xiàn)，但有凋亡樣細胞形態(tài)。為了進一步證實自噬的發(fā)生，我們采用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116，HCT116 Bax-/-和HCT116 PUMA-/-細胞，5-FU處理后進行熒光顯微鏡檢測，在缺失細胞

8、處理組中發(fā)現(xiàn)明顯的散點狀熒光分布，而野生型對應組為彌散樣熒光分布。PI3K-Akt-mTOR是自噬發(fā)生的負調(diào)控機制，在癌細胞中，mTOR的抑制已被認為與自噬的發(fā)生緊密相連，它的關(guān)鍵下游底物是p70s6k。因此我們利用Western blot檢測和比較野生型和凋亡缺失細胞中p70s6k的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)凋亡缺失細胞中p70s6k的表達水平明顯低于野生型細胞，表明凋亡缺失細胞中自噬性信號通路被激活。這些結(jié)果證實在5-FU處理的凋亡缺失細胞

9、中存在自噬的發(fā)生。 (二)抑制自噬降低凋亡缺失細胞對5-FU的敏感性 自噬是一個高度保守的過程，而在一些特定的情況下，它也可以作為一種細胞死亡方式。在這部分實驗中，我們使用3-MA(3-甲基腺嘌呤)作為自噬的抑制劑，電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)5-FU聯(lián)合3-MA處理的細胞中只有很少或幾乎沒有自噬泡的出現(xiàn)；5-FU單獨處理誘導的點狀熒光分布在聯(lián)合3-MA處理后也變?yōu)閺浬訜晒夥植?。在相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，臺盼藍染色法檢