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文檔簡介
1、趨磁菌Magnetospirillum AMB-1產生的磁小體是一種晶型完美、單分散性、生物性能良好的納米級Fe3O4型磁性微球,其粒徑分布在50-100nm,磁學特性與通過化學合成的磁性微球相當。磁小體作為一種有待于開發(fā)利用的磁性納米材料,現已在醫(yī)學、生物學、電子學以及航天工業(yè)有所應用。目前,在通過培養(yǎng)條件優(yōu)化方法來提高AMB-1生長密度及增強磁小體合成能力的研究中發(fā)現培養(yǎng)環(huán)境中的氧氣濃度是一個重要因素:氧氣濃度太高或太低會對菌體生長
2、及磁小體的合成產生明顯的抑制作用。本研究主要嘗試對AMB-1的抗氧化代謝系統(tǒng)在菌體生長、磁小體合成中的重要作用進行初步探索研究。
1.AMB-1的兩個超氧化物歧化酶基因(fesod和cu/znsod)的生物信息學分析
對趨磁菌AMB-1的兩個超氧化物歧化酶Fe-SOD及Cu/Zn-SOD從初級結構到空間結構等生物信息學方面進行初步研究。結果表明:fesod基因全長597bp,編碼199個氨基酸,不含有信號肽序列,在1
3、19到137氨基酸間可能存在一個跨膜結構,其蛋白三級預測結構同Thermophilic CyanobacteriumThermosynechococcus Elongatus中的Fe-SOD最為相似;cu/znsod基因全長531bp,編碼177個氨基酸,可能含有信號肽序列,并且在前50個氨基酸序列可能存在2個跨膜結構,其蛋白三級預測結構同Salmonella typhimurium中的Cu/Zn-SOD最為相似。
2.AMB
4、-1超氧化物歧化酶基因(fesod和cu/znsod)在大腸桿菌中的克隆表達
在本研究中,趨磁菌AMB-1來源的fesod和cu/znsod在大腸桿菌BL21(DE3)中進行克隆表達。通過PCR的方法從AMB-1的基因組中擴增到兩個SOD基因片段,分別連接到IPTG誘導型表達載體pET-20b上,得到重組質粒pET-20b-fesod-histag和pET-20b-cu/znsod-histag,并電轉化E.coil BL21
5、(DE3)。生長曲線表明:重組菌株BL21(DE3)/(pET-20b-cu/znsod-histag)以及BL21(DE3)/(pET-20b-fesod-histag)生長速率及生長最終密度明顯高于對照組BL21(DE3)/(pET-20b)。重組菌株BL21(DE3)/(pET-20b-fesod-histagl)以及BL21(DE3)/(pET-20b-cu/znsod-histag,)單位細胞中SOD活力明顯高于對照組BL21
6、(DE3)/pET-20b)。SDS-PAGE蛋白電泳分析發(fā)現:fesod得到了有效表達,蛋白分子量約為22 KDa;在BL21(DE3)/(pET-20b-cu/znsod-histag)重組菌株的誘導表達中,一個推測為宿主菌中SOD蛋白(分子量約為24 KDa)的表達水平逐漸上升,而cu/znsod沒有得到表達。
3.通過基因工程手段提高AMB-1超氧化物歧化酶的表達水平
為提高趨磁菌AMB-1對氧的耐受水平,嘗
7、試通過基因工程手段增強該菌內Fe-SOD和Cu/Zn-SOD兩種超氧化物歧化酶的表達水平。利用可以在革蘭氏陰性菌中復制遺傳的廣宿主載體pBBR1-MCS-4,實驗中構建了兩個游離型重組載體pBBR1-P16-fesod-histag和pBBR1-P16-cu/znsod-histag。同時,利用AMB-1基因組中的rDNA作為同源整合的目標序列區(qū)段,實驗中構建了兩個同源重組整合型載體pET-20b-rDNA-P16-fesod-hist
8、ag和pET-20b-rDNA-P16-cu/znsod-histag。在構建的載體中,氨芐青霉素抗性基因(ampr)作為主要的篩選標記,AMB-1中組成型強啟動子P16和來源于pET-20b的T7轉錄終止子構成主要的表達元件。通過電轉化,游離型載體尚未能夠成功轉入AMB-1中,整合型載體也未能整合至基因組的rDNA區(qū)段。
4.不同濃度的還原劑對AMB-1菌體生長及磁小體合成的影響
為探索AMB-1生長及磁小體合成的
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