不同接頭的白蛋白干擾素α-2b在畢赤酵母中表達(dá)量及生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的：人血清白蛋白是血漿中含量較高的一種蛋白，在體內(nèi)能夠與許多物質(zhì)結(jié)合，同時(shí)白蛋白也是一些藥物的良好載體。在體內(nèi)可以有效的延長藥物的半衰期，而且也不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生免疫原性。本實(shí)驗(yàn)主要是通過構(gòu)建不同接頭的pPIC9K-HSA-IFNα-2b，然后用salⅠ酶線性化，電轉(zhuǎn)化Pichia.PastorSMD1168，將陽性轉(zhuǎn)化子在合適的條件下，用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，取上清進(jìn)行SDS-PAGE、Western-Blot鑒定，再用酶聯(lián)免疫吸附法(ELIS

2、A)測定融合白蛋白干擾素的表達(dá)量，最后用細(xì)胞病變抑制法(Wish細(xì)胞-VSV病毒)測定其抗病毒活性。
　　 方法：在白蛋白與干擾素之間通過重疊PCR獲得不同的接頭的白蛋白干擾素，接頭的氨基酸數(shù)分別是15、10、5，在相同的條件下，先對(duì)每一種接頭的白蛋白干擾素進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，篩選出表達(dá)量最高的一個(gè)，然后分別取三種表達(dá)量最高的克隆在相同的條件下甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，分別測定表達(dá)量，比較大小。根據(jù)表達(dá)量的差異，用500mL搖瓶培養(yǎng)，初步分離純化

3、蛋白，最后再用細(xì)胞病變抑制法測定其活性大小，分別計(jì)算出比活。
　　 結(jié)果：通過重疊PCR構(gòu)建的三種接頭蛋白的重組子，在畢赤酵母中表達(dá)，15個(gè)氨基酸linker、10個(gè)氨基酸linker、5個(gè)氨基酸linker的表達(dá)蛋白濃度分別是194mg/L、135mg/L、177mg/L。三種接頭的白蛋白干擾素比活差異較小，比干擾素α-2b的比活低了很多，可能是白蛋白的存在影響了干擾素α-2b的活性位點(diǎn)。
　　 結(jié)論：我們發(fā)現(xiàn)15個(gè)氨