重組牛腸激酶酶學(xué)性質(zhì)及動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、腸激酶(EK,EC3.4.21.9)是一種在基因工程產(chǎn)品中廣泛應(yīng)用的工具酶,是哺乳動(dòng)物消化系統(tǒng)中最基礎(chǔ)的絲氨酸蛋白水解酶之一,由1條結(jié)構(gòu)亞基(重鏈)和1條催化亞基(輕鏈)構(gòu)成,催化亞基可以特異性識(shí)別胰蛋白酶原中Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下,將胰蛋白酶原活化為胰蛋白酶,從而啟動(dòng)各種酶原活化的級(jí)聯(lián)[1]。
　　 本文研究的腸激酶是酵母表達(dá)的重組激酶,其輕鏈接近電泳單一純,主要是通過(guò)催化熒光底物Gly

2、-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamide(簡(jiǎn)稱(chēng)GD4K-β-萘胺)水解跟蹤法,對(duì)該酶制劑的一些活性影響因素進(jìn)行研究,探討了該酶的酶學(xué)特性、活力調(diào)控、催化作用機(jī)理,從而填補(bǔ)國(guó)內(nèi)在這方面的研究空白。
　　 化學(xué)修飾研究結(jié)果表明:半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基是酶的活性功能基團(tuán),而根據(jù)β-巰基乙醇(β-ME)、二硫蘇糖醇(DTT)、冰醋酸、甲醛等修飾劑的修飾反應(yīng),表明二硫鍵、氨基不是維持酶活力的必需基團(tuán)

3、。并采用鄒承魯?shù)牡孜锓磻?yīng)動(dòng)力學(xué)方法推算出酶分子中僅有一個(gè)半胱氨酸殘基是酶活性所必需的,該基團(tuán)的修飾將導(dǎo)致酶活力的喪失。
　　 根據(jù)DTNB對(duì)該酶的強(qiáng)烈抑制作用,研究了其抑制動(dòng)力學(xué),DTNB對(duì)酶的抑制作用是可逆過(guò)程。從直線的斜率求得其抑制常數(shù)K1為0.11 mmol/L。DTNB在一定濃度下對(duì)酶的效應(yīng)表現(xiàn)為慢可逆的抑制過(guò)程,對(duì)酶的抑制作用屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用,同時(shí)建立動(dòng)力學(xué)模型,測(cè)定抑制劑與游離酶(E)和酶-底物絡(luò)合物(ES)結(jié)合

4、的微觀速率常數(shù)k+0及k-0。
　　 根據(jù)大規(guī)模生產(chǎn)中常用的變性劑種類(lèi),選取了鹽酸胍、CPC、硫脲、尿素進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究,結(jié)果表明以上變性劑對(duì)該酶均具有較強(qiáng)的抑制活性,其IC50分別為0.025 mol/L、0.32 mmol/L、0.080 mol/L、0.75 mol/L,抑制常數(shù)K1分別為0.015mol/L、0.26 mmol/L、0.060 mol/L、0.553 mol/L,鹽酸胍、硫脲、尿素對(duì)該酶的抑制作用均屬于競(jìng)爭(zhēng)