重組大腸桿菌高效生產具生物活性的人β-防御素和牛腸激酶的研究.pdf

1、人β-防御素是近來年發(fā)現的具有廣譜抗菌活性并在機體抵御外來微生物入侵中起防御作用的一類陽離子抗菌肽.腸激酶是哺乳動物腸道內的一種絲氨酸蛋白水解酶,能夠特異性的識別(Asp)<,4>-Lys序列,起到把胰蛋白酶原轉變成胰蛋白酶的作用. 本論文研究了使用基因工程技術生產人β-防御素3及4(HBD3、HBD4)和牛腸激酶輕鏈(BEKLC)的方法.建立了從獲得HBD3、HBD4和牛腸激酶輕鏈基因、載體構建、表達優(yōu)化、產物分離純化、BEK

2、LC包涵體復性,直到生物活性測定等的完整工藝. 經過密碼子優(yōu)化全基因合成了HBD3及4的基因,構建了大腸桿菌融合表達HBD3及4的基因工程菌,通過對搖瓶表達條件的研究,獲得了如下的優(yōu)化培養(yǎng)條件:在:MBL培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度為34℃,在對數生長中期添加終濃度為0.4 mM的IPTG進行誘導的情況下,HBD3和HBD4重組菌分別誘導8 h和6h終止發(fā)酵,首次實現了融合蛋白的高水平表達.HBD3融合蛋白的產量為2.55g/L,HBD4融

3、合蛋白的產量達到2.68 g/L. 經過密碼子優(yōu)化全基因合成了牛腸激酶輕鏈基因(sBEKLC),采用質粒pET-39b(+)構建了融合表達載體,成功地在大腸桿菌中進行了表達,融合蛋白產量達到151.2 mg/L,i.e.80.6 mg/L sBEKLC.使用滲透沖擊技術從細胞周質中提取sBEKLC,經過親和層析可從每升發(fā)酵液中得到6.8mg sBEKLC,在類似的研究工作中處于較高的水平.經檢測,sBEKLC具有生物活性.

4、 部分表達的sBEKLC融合蛋白為不可溶,應用鎳離子金屬螯地合層析對包涵體進行了純化和復性研究,優(yōu)化的復性條件為:50 mM Tris-HCl(pH 8.0),0.3 MNaCl.2 M urea,10 mM Imidazole,3 mM GSH,0.6 mM GSSG條件下,復性6 h結束,復性產物具有生物活性. 將自制的腸激酶輕鏈成功地用于人防御素融合蛋白的切割以釋放出有生物活性的成熟的產物.對重組菌生產的人β-防御素-3